タンパク質の晶析は、複雑な高分子において構造化された規則的な結晶格子を配列するための操作や方法を指します。一般的に、タンパク質は固体時はアモルファスであり変性しやすいのに対して、結晶格子として存在するタンパク質は変性を受けにくく、優れた安定性を備えています。タンパク質は、適切な環境下に置かれると結晶化する可能性があります。タンパク質の結晶化は、晶析プロセスに影響を与える変数のきわめて複雑な相互作用によって生じるため、科学であると同様に芸術でもあると考えられています。
タンパク質の結晶を作成する最も一般的な理由として、通常はX線回折結晶学により行う構造生物学の調査のサポートが挙げられます。タンパク質の3次元構造を理解することによって、研究者は他の分子との相互作用が可能なフレームワークの領域を視覚化できます。（たとえば酵素、基質、リガンドがどのように相互作用を及ぼすかの理解をより深めるため）さらに、晶析は、他のタンパク質や外部の生物学的物質による汚染のない純粋なタンパク質を作成するための効果的な手段であるため、分取クロマトグラフィーに代わる精製と分離のための手段となり得ます。
タンパク質は、治療薬として重要性が高まりつつあります。しかし、必要な安定性を備えたタンパク質の製造には、製品のばらつき、有効性の低下につながる構造欠損、潜在的に危険な副生成物の形成といった重要な課題があります。タンパク質の晶析は、高純度で安定性の高い固形製剤やタンパク質の結晶に関連する多くの注射/点滴治療薬を製造するための方法です。かつてのタンパク質の晶析は、Ｘ線結晶構造解析をサポートするためにラボスケールで行われていました。しかし、タンパク質ベースの治療薬の指数関数的な増加により、タンパク質の晶析を製造レベルまでスケールアップすることがますます重要になり、大きな注目を集めています。
タンパク質の晶析のスケールアップは、基本的には低分子の晶析と類似しています。ラボスケールでは重要なプロセスパラメータ（Critical Process Parameters CPPs）を最適化し、製造スケールで結晶化した医薬品原体の重要な品質属性（Critical Quality Attributes CQA）を達成する必要があります。タンパク質の晶析プロセス開発とスケールアップのための包括的なプラットフォームには、一般的に以下の項目が求められます。
タンパク質の晶析に関連する製薬領域における主要なアプリケーション: 構造生物学によるメディカルケミストリー、タンパク質医薬品の開発、スケールアップ、分離/精製、製剤、ドラッグデリバリー。
タンパク質の結晶を成長させるためにいくつかの方法が使用されていますが、この中で最も一般的なのは蒸気拡散とマイクロバッチです。蒸気拡散には、ハンギングドロップとシッティングドロップと呼ばれる2つのバリエーションがあり、いずれも基本的に機能は同じです。密閉された系で、タンパク質、緩衝液、沈殿剤を含む溶液の液滴が、より溶質濃度が高く、しかしタンパク質を含まないリザーバーと平衡状態になります。タンパク質が含まれる液滴中の水は蒸発し、リザーバー内のより濃度の高い溶液に引き寄せられます。液滴内の溶質の濃度が上がると、タンパク質の晶析が始まります。マイクロバッチ法では、タンパク質と他の試薬を導入し、水の拡散を防ぐ鉱物油の薄層で覆います。マイクロバッチは、晶析を起こすために必要なすべての成分を適切な安定した濃度で含む小さなリアクターです。
タンパク質の晶析に必要な適切な試薬、パラメータ、条件は経験に基づくことが多いことから、タンパク質の晶析を成功させる最も現実的な方法は、これまでの経験に基づいた幅広い実験条件を使用することです。これを達成する最も簡単な方法は、緩衝液や沈殿剤などが入ったマルチウェルプレートとしてパッケージされた市販のタンパク質結晶スクリーニングキットを使用することです。これらのキットを使用して結晶を成長させるためには、ハンギングドロップ蒸気拡散法を使用します。大規模なスクリーニングが必要な場合は、マイクロバッチ法を自動化したハイスループットシステムを使用することで、時間と手間を抑えると同時に、必要な精製タンパク質の量を最小限に抑えることができます。製薬または産業用途で求められる大規模なタンパク質の晶析の場合、スクリーニング実験で得られた情報は、in situのリアルタイムPATを特徴とする大規模自動合成装置システムへの適用の基盤となります。
プロセス開発と製造をサポートすることにおいて、タンパク質の晶析を成功させるための最初の最重要ステップの1つが、高純度で十分に品質が確認されたタンパク質を適切な供給方法で確保することです。タンパク質が高純度である（つまり発酵マトリクス由来の不純物などといった汚染がない）ことに加えて、溶液中でタンパク質が均質で安定していなければなりません。また、次の条件があります。
さらに、タンパク質の晶析プロセスに使用するどの試薬と溶媒にも汚染物質が含まれていてはなりません。これは、核形成に大きな影響を与えるからです。
低分子の晶析と同様に、タンパク質は過飽和溶液から晶析します。堅牢な結晶格子を形成する低分子において、過飽和に到達するための第1の手段は温度の操作です。これはタンパク質にも有効です。ただし、通常タンパク質結晶は結晶構造の一部として溶媒が含まれ、温度の影響を受けやすいことが多く、変性と凝集が起こりやすいことから、温度範囲を下げることのみ許容されます。
低分子は立体構造の自由度が大幅に低いことから、晶析は比較的簡単です。高分子ペプチドでは、酸性、塩基性、極性、非極性の相互作用や秩序ある結晶化に対する反発力がタンパク質が大きくなるほど増えます。晶析に適合性のあるほとんどのペプチドには、構造モチーフを固定するために非常に重要である多くのジスルフィド結合があります。分子内の障害や構造の変化の程度は、ペプチドやタンパク質が沈殿ではなく結晶化するかどうかを決定する重要な属性です。分子が結晶化しやすい属性を持っている場合でも、プロセスの商業的な実現の可能性に影響を与え、特性評価が必要なプロセスパラメータがいくつかあります。
温度のほかにも、溶液のpH調整やイオン強度、タンパク質の溶解度を下げるPEGなどの塩や沈殿剤の添加、存在するリガンドの種類など、過飽和によるタンパク質の結晶化に影響を与えるあるいは支援する多くの因子があります。鍵となるのは、タンパク質の通常の特性に悪影響を与えない環境内で溶液を過飽和状態にすることです。これは、適切な形態、純度、許容可能な成長速度を備えた結晶が得られる、一連の変数と条件の組み合わせを見つけることが重要であることを意味しています。
タンパク質ベースの治療薬の晶析を開発し、スケールアップするには、晶析プロセスに影響を与える変数と条件の理解を深める必要があります。他の晶析と同様に、目的の結晶多形、形状、粒子サイズ、粒度分布の実現には、再現性のある製品品質を達成する慎重な制御が必要です。タンパク質の結晶懸濁液のCQAのばらつきは、治療の有効性に直接影響を与えます。タンパク質の結晶はその成長環境に非常に敏感で、極端な温度、溶媒のロス、その他の外的なストレス、さらにはサンプリングによって簡単に損傷する可能性があるため、結晶をその溶液環境から取り出さず、CPPと製品の品質をin situで測定することが望ましいとされています。
自動合成装置をリアルタイムのin situ分析装置と組み合わせて使用すると、成長、凝集、破砕、形状変化などの晶析メカニズムに与えるプロセスパラメータの影響を特定できます。結晶形成の進捗状況をin situで継続的にモニタリングすることと晶析プロセスを高精度に制御することを組み合わせることで、最適化とスケールアップを事実とデータに基づいて行うことが可能になります。
自動合成装置EasyMaxは、タンパク質の晶析のパラメータの最適化に最適なワークステーションであり、プロセス開発とスケールアップをサポートします。このシステムは完全な自動化が可能であり、プロセスパラメータを高い精度で制御できます。
ReactIRは、中赤外分光法を使用して晶析の溶液相を測定します。ReactIRの測定は、浮遊物質、気泡、その他の粒子状物質の影響を受けません。
ReactRamanは、ラマン分光法を使用して溶液内の粒子の分子分析を行います。
ParticleTrackは、収束ビーム反射測定法（FBRM）技術を使用したプローブ型の光学装置です。さまざまなリアクターに直接挿入し、変化する粒子サイズとカウントをリアルタイムで追跡します。ParticleTrackは、コード長分布測定値を使用して結晶粒度分布（CSD）を取得します。
EasyViewerはプローブ型の機器で、容器に直接挿入して粒子の画像を捉えます。EasyViewerは画像解析を行い、プロセスを時間分解した連続的なインライン画像から粒子数、粒度分布、形状を測定し、これによって経時的な傾向を分析することができます。
Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Real-Time Monitoring of Biopharmaceutical Crystallization: Chord Length Distribution to Crystal Size Distribution for Lysozyme, rHu Insulin, and Vitamin B12.Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.
著者らは、バイオ医薬品の晶析をリアルタイムでモニタリングする効率的なアプローチの開発に成功したことを報告しています。この方法は、ParticleTrackを使用し、静的条件と動的条件の両方で一連のバイオ医薬品分子のCLDを測定します。次に数学的モデリングを適用して、CLDからCSDに変換します。研究対象の生体分子には、晶析の実験条件に依存するいくつかの異なる結晶多形がありました。リゾチームは正方晶と針状の結晶を生成することができ、rHuインスリンは菱面体晶を、B12は多面体の結晶を形成します。
著者らは、低アスペクト比の正方晶、菱面体晶、多面体結晶、また高アスペクト比の針状結晶のCSDを測定するモデルを開発しました。また、3つの異なるモデルを使用して結晶粒度分布を確認しました。
FBRM測定からCSDを算出するために開発したモデルの結果を、画像解析で得られたCSD測定と比較しました。
不透明な結晶スラリーをモニタリングしようとすると、特に製造の仕様で狭い粒度分布（PSD）が求められる場合に問題が発生します。注射用のタンパク質結晶の製剤においてPSDは、粘度に大きな影響を与えるだけではなく、製剤でリスクとなる可能性のある凝集やその他の分解現象を早期に警告します。in situモニタリングをバッチ晶析のスケールアップの研究で使用し、ヒト成長ホルモン（hGH）の結晶形成と成長の特性評価を行いました。リアルタイム分析によって、リアクター間での撹拌の違いによって通常のPSDプロファイルからの逸脱が生じていることが検出されました。これは、その後のオフライン画像分析（IA）で確認されています。