Spettroscopia Uv Vis: conoscenze essenziali

Gli elementi costitutivi della spettroscopia Uv Vis, tra cui bilance per colore, fondamenti, strumentazione e taratura.

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Spettroscopia uv vis
Che cos'è la spettroscopia uv vis?
Spettro uv/visibile

Convertitore Assorbanza/Trasmittanza

=

Assorbimento della luce secondo la legge di Beer-Lambert
Spettrofotometro a scansione
Spettrofotometro a scansione

Gli spettrofotometri a scansione convenzionali funzionano in base al principio di effettuare misurazioni consecutive della trasmittanza ad ogni lunghezza d'onda definita. La luce viene suddivisa in diverse lunghezze d'onda da una griglia di diffrazione. Una cuvetta campione viene posizionata tra la griglia di diffrazione e il rilevatore.

Spettrofotometro a raggiera
Spettrofotometro a raggiera

In uno spettofotometro array, il campione viene illuminato da un continuum, cioè da tutti i componenti spettrali della luce contemporaneamente, quindi assorbe la luce di diverse lunghezze d'onda contemporaneamente. La luce trasmessa viene poi diffratta da una griglia di riflessione. Questa strumentazione aiuta ad acquisire lo spettro uv-vis più velocemente di quanto si possa ottenere con uno spettrofotometro a scansione tradizionale.

Spettroscopia uv vis a raggiera contro spettroscopia uv vis a scansione

Test di prestazione

Materiale di riferimento certificato (CRM)

Strumento Parametro del test

Criteri di accettazione

USP 42 NF 37

Ph. Eur. 10

Accuratezza della lunghezza d'onda e

ripetibilità

Ho(ClO4)3: 4 % Ho2O3 in 10 % v/v HClO4

Vuoto: Aria

14 lunghezze d'onda

(240 nm - 650 nm)

Xe: 2 lunghezze d'onda (260,6, 528,6 nm)

UV (200 - 400 nm): ± 1 nm

Vis (400 - 780 nm): ± 2 nm

(S.D.) < 0,5 nm

UV (< 400 nm):

± 1 nm

Vis (> 400 nm):

± 3 nm

Fotometria

precisione e

ripetibilità**

K2Cr2O7 in 0,001 M HClO4

Bianco: 0,001 M HClO4

60 mg/L

0 A - 2 A,

235, 257, 313, 350 nm

Per l'assorbanza ≤ 1A

Precisione: ± 0,010A

Ripetibilità:

D.S. ≤ 0,005 A

 

Per assorbanza > 1A

Precisione: ± 1%

Ripetibilità:

S.D. ≤ 0,5%

 

Precisione: ± 0,010 A o ± 1 %, a seconda di quale dei due è maggiore

 

Acido nicotinico in

0,1 M HCl

Bianco: 0,1 M HCl

12 mg/L

0,26 A - 1,6 A

213, 261 nm

Linearità fotometrica

K2Cr2O7 in 0,001 M HClO4

Bianco: 0,001 M HClO4

 

6 - 200 mg/L, fino a 3,0 A,

235, 257, 313, 350 nm

Tutti i filtri misurati soddisfano i criteri di accettazione dell'accuratezza fotometrica  

R2> 0,999

Acido nicotinico in

0,1 M HCl

Bianco: 0,1 M HCl

6 - 60 mg/L, fino a 2,5 A

213, 261 nm

Luce diffusa secondo la procedura A

(SFRM)

1,2 % w/v KCl/H2O;

Lunghezza del percorso 10 mm

Bianco: 1,2 % w/v KCl/H2O, lunghezza del percorso 5 mm

Amax a 198 nm

≥ 0.7 A

(NA)

Luce diffusa secondo la procedura B (SWM)

1,2 % w/v KCl/H2O;

Lunghezza del percorso 10 mm

Vuoto: H2O, lunghezza del percorso 10 mm

Amax a 198 nm

≥ 2.0 A

≥ 2.0 A

Risoluzione

0,02 % v/v toluene in n-esano

Bianco: n-esano/

n-eptano (Ph. Eur. 10)

Amax,269/Amin,267

>1.3

I livelli sono indicati nella rispettiva monografia

** Nessuna specifica della ripetibilità fotometrica (precisione) in Ph. Eur.

S.D. - Deviazione standard

Nozioni di base sulla misurazione del colore uv-vis.
Numero di colore
Qual è il colore di questa rosa?

Per definire in modo univoco un prodotto secondo le bilance industriali, vengono stabilite diverse bilance di colori. Queste bilance includono:

Bilance

Standard

Applicazioni

Saybolt

ASTM D156, ASTM D6045

Per determinare se il carburante (cherosene, benzina, diesel, nafta, ecc.) è contaminato o si è degradato durante lo stoccaggio.

APHA/Pt-Co/Hazen

ASTM D1209

Indice di giallo utilizzato come metro per i controlli di purezza nell'industria idrica, chimica, petrolifera e delle materie plastiche.

Gardner

ASTM D1544/D6166, DIN EN ISO 4630-2

Per testare prodotti come le resine, gli acidi grassi, le vernici e gli oli essiccanti che hanno raggiunto il colore attraverso il riscaldamento.

CIELAB

DIN EN 11664-4, DIN 5033-3, 4630, ASTM Z 58.7.1 DIN 6174

Controllo di qualità per l'industria degli aromi e dei profumi e per l'industria alimentare e delle bevande

CIELab Misurazione del colore - spettroscopia uv-vis

EBC

Metodo MEBAK 2.13.2, Metodo EBC 8.5, Metodo EBC 9.6

Per misurare l'intensità del colore e la torbidità (foschia) in unità EBC di birra, malti, caramello, ecc.

USP/EUP

USP-24 Monografia 631, metodo EP 2.2.2

Controllo di qualità dei farmaci

Hess-Ives

Metodo di prova DGK F 050.2

Utilizzato per testare prodotti chimici e liquidi tensioattivi (soprattutto nell'industria cosmetica)

 

Controllo di qualità degli acidi nucleici
Cuvette per l'analisi UV Vis

La tabella che segue indica gli intervalli di trasmissione utilizzabili delle cuvette:

Materiale

Intervallo di trasmissione teorico (nm)

Quarzo UV lontano

170-2700

Vetro ottico

320-2500

Quarzo vicino all'IR

220-3800

Silice UV

220-2500

Plastica UV

220-900

Cella PS monouso

340-750

Cella PMMA monouso

285-750

 

Cuvetta per spettroscopia uv vis

 

Soluzioni acquose

Molecole organiche

Particelle difficili da rimuovere

Proteine

Metalli pesanti

Acidi grassi

Soluzioni di pulizia

Parti uguali in volume di HCl 3 M ed etanolo

 

Lavaggio con acido nitrico al 50%

HNO concentrato3 o 2 M HCl

Parti uguali in volume di etanolo e 3 M HCl

 

 

Incubare a temperatura ambiente con tripsina

 

(L'etanolo e l'acetone non sono consigliati per la pulizia).

Parti uguali in volume di acido solforico 2 M e acqua deionizzata al 50%.

 

Aqua regia

 

 

Parti uguali in volume di IPA e acqua deionizzata

Tempo di immersione*

10 minuti

10 minuti

30 secondi

Per tutta la notte

20 minuti

Asciugare

*Il tempo di immersione indicato nella tabella è una stima approssimativa; tuttavia, si raccomanda di immergere le cuvette solo finché le macchie/contaminanti non vengono rimosse.

Spettroscopia uv vis nell'industria alimentare
Spettroscopia uv vis nell'industria farmaceutica
Spettroscopia uv vis nell'industria cosmetica
Spettroscopia uv vis nell'industria petrolchimica
Spettroscopia uv vis nell'industria chimica
Spettroscopia uv vis nella biotecnologia

Quali sono i diversi tipi di spettroscopia?

Le diverse tecniche spettroscopiche si differenziano principalmente in base alla radiazione utilizzata, all'interazione tra l'energia e il materiale, al tipo di materiale e alle applicazioni per cui vengono utilizzate. Le tecniche spettroscopiche comunemente utilizzate per l'analisi chimica sono la spettroscopia atomica, la spettroscopia ultravioletta e visibile (uv vis), la spettroscopia a infrarossi, la spettroscopia Raman e la risonanza magnetica nucleare.

Tipo di spettroscopia

Tipo di radiazione

Interazioni

Lunghezza d'onda

Spettroscopia dei raggi ϒ

Raggi ϒ

Nuclei atomici

< 0,1 nm

Spettroscopia di fluorescenza a raggi-X

Raggi-X

Elettroni del guscio interno

0,01 - 2,0 nm

Spettroscopia uv sotto vuoto

Ultravioletto (UV)

Ionizzazione

2,0 - 200 nm

Spettroscopia uv vis

Uv Vis

Elettroni di valenza

200 - 800 nm

Spettroscopia a infrarossi e Raman

Infrarossi

Vibrazioni molecolari

0,8 - 300 mm

Spettroscopia a microonde

Microonde

Rotazioni molecolari

Da 1 mm a 30 cm

Spettroscopia di risonanza di spin di elettroni

Spin degli elettroni

Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare

Onde radio

Spin nucleare

0.6 - 10 m

 

Quali sono le diverse interazioni molecolari nella regione UV?

Tipi di transizione nella regione UV

In che modo i gruppi funzionali influenzano gli spettri?

Consideriamo un gruppo funzionale contenente atomi con una o più coppie di elettroni solitari che non assorbono le radiazioni ultraviolette/visibili. Tuttavia, quando questo gruppo funzionale è collegato a un cromoforo, altera l'intensità e la lunghezza d'onda dell'assorbimento. Questo fenomeno si chiama auxocromo o gruppo di potenziamento del colore.

La presenza di un auxocromo provoca lo spostamento di posizione di un picco o di un segnale verso una lunghezza d'onda maggiore, che si chiama batocromia o spostamento verso il rosso. I gruppi funzionali che contribuiscono ai gruppi batocromici sono i substituenti come metile, idrossile, alcossi, alogeni e gruppi amminici.

L'auxocromo che provoca lo spostamento della posizione di un picco o di un segnale verso una lunghezza d'onda inferiore è chiamato ipocromico o blue shift. In realtà, la combinazione di cromoforo e auxocromo si comporta come un nuovo cromoforo che ha un massimo di assorbimento diverso (λmax). Ad esempio, il benzene mostra λmax a 256 nm, mentre l'anilina mostra λmax a 280 nm. Quindi, il gruppo NH2 agisce come un auxocromo e provoca lo spostamento di λmax a un valore maggiore.

Qual è la differenza tra larghezza di banda spettrale e risoluzione nella spettroscopia uv vis?

La larghezza di banda spettrale (SBW) di uno spettofotometro è legata alla larghezza fisica della fessura e alla dispersione ottica del sistema monocromatore. La risoluzione è la capacità di uno strumento di separare la luce in regioni di lunghezza d'onda finite e distinte e di distinguere ciascuna regione finita. La larghezza di banda spettrale è tipicamente utilizzata per gli strumenti a scansione, mentre la risoluzione è tipicamente utilizzata per gli strumenti ad array.

Per la maggior parte degli scopi quantitativi della farmacopea, è sufficiente una larghezza di banda spettrale inferiore a 2 nm e il criterio di accettazione per il rapporto è 1,3. La risoluzione spettrale può essere utilizzata per il confronto con la larghezza di banda spettrale.

La tabella mostra la risoluzione degli spettrofotometri uv/vis Excellence di METTLER TOLEDO, misurata utilizzando toluene in esano, e l'equivalente SBW.

Strumento

Risoluzione spettrale

SBW equivalente (nm)

UV5

> 1.5

< 2.0

UV5Bio

> 1.5

< 2.0

UV5Nano

> 1.7

< 1.5

UV7

> 1.9

≤ 1.0

 

Quali sono le diverse sorgenti luminose utilizzate in uno spettrofotometro UV vis?

La migliore sorgente luminosa è quella che fornisce una buona intensità con un basso rumore in tutte le lunghezze d'onda ultraviolette e visibili e che offre stabilità per un lungo periodo. Esiste una gamma di sorgenti luminose che vengono comunemente impiegate, come indicato di seguito.

Sorgente luminosa

Gamma di lunghezza d'onda

(nm)

Regione

Durata di vita

Lampada a filamento di tungsteno

350 - 2500

VIS + IR

3.000 ore

Lampada ad arco di deuterio

190 - 400

UV

1.000 ore

Lampada a idrogeno

190 - 400

UV

1.000 ore

Lampada flash allo xeno

190 - 1100

UV + VIS + NIR

5.500 ore*

* Corrisponde a 50 Hz di flash a funzionamento costante

In che modo il reticolo di diffrazione è migliore di un prisma?

I prismi e i reticoli di diffrazione sono elementi dispersivi tipici. Un prisma ottiene la dispersione grazie alla differenza dell'indice di rifrazione del materiale in base alla lunghezza d'onda. Tuttavia, un reticolo di diffrazione utilizza la differenza nella direzione di diffrazione per ogni lunghezza d'onda a causa dell'interferenza. Sia i prismi che i reticoli di diffrazione possono suddividere gli spettri luminosi in molti colori per l'analisi. Tuttavia, un reticolo di diffrazione è meno sensibile al colore della luce e può essere realizzato per diffondere i colori su un angolo più ampio rispetto a un prisma. Il vetro di un prisma è trasparente alla luce visibile, ma assorbe e blocca la luce nella parte infrarossa e ultravioletta dello spettro. Una griglia di diffrazione con alcune centinaia di linee per pollice può deviare la luce nel mezzo dello spettro visibile di almeno 20 gradi. L'angolo di deflessione di un prisma di vetro è generalmente molto più piccolo di questo.

Quali composti inorganici possono essere misurati con la spettroscopia uv vis?

Le molecole possono essere analizzate con la spettroscopia uv vis se possiedono un gruppo funzionale o una coniugazione, oppure se producono un complesso di colore. Poiché i composti inorganici non contengono alcun gruppo funzionale o coniugazione, il metodo comune per analizzarli è la reazione con un composto adatto. Questo produce un complesso colorato la cui assorbanza può essere misurata fotometricamente nella regione del visibile e correlata alla sua concentrazione effettiva. Ad esempio, il ferro viene comunemente analizzato mediante una reazione con 1, 10-fentrolina per produrre un complesso di colore rosso. L'assorbanza del complesso viene misurata a 570 nm per stimare la concentrazione di ferro.

In cosa differiscono gli spettrofotometri a singolo raggio e a doppio raggio?

La differenza principale tra uno spettrofotometro a singolo raggio e uno a doppio raggio è la seguente.

Spettrofotometro a singolo raggio: Un singolo raggio proveniente dalla sorgente luminosa attraversa il campione.

Spettrofotometro a doppio raggio: Il fascio di luce proveniente dalla sorgente luminosa viene diviso in due parti: una parte passa attraverso il campione e l'altra passa attraverso il riferimento.

La divisione del fascio in uno spettofotometro a doppio raggio si ottiene in due modi:

  1. in modo statico, con specchi parzialmente trasmittenti o un dispositivo simile
  2. attenuando i fasci con dispositivi ottici e meccanici in movimento

Come analizzare un film polimerico solido utilizzando l'uv-vis?

Come analizzare un film polimerico solido utilizzando l'uv-vis?

La temperatura influisce sull'analisi uv vis?

La temperatura influisce sui valori di assorbanza. I diversi solventi subiscono interazioni diverse a temperature diverse. I parametri della soluzione che cambiano a causa delle variazioni di temperatura sono:

  • Velocità di reazione. La velocità cambia quando la temperatura è elevata. Questo può causare un cambiamento nell'attività del campione. Le reazioni enzimatiche/biomolecolari sono molto sensibili alla temperatura.
  • Solubilità di un soluto. La solubilità è influenzata dalle variazioni di temperatura. Una scarsa solubilità può provocare un assorbimento impreciso.
  • Espansione o contrazione del solvente. Questo può portare a una variazione della concentrazione della soluzione e influenzare l'assorbanza, in quanto l'assorbanza è linearmente correlata alla concentrazione.
  • Effetto Schlieren. Questo effetto può verificarsi con le variazioni di temperatura, determinando una serie di correnti convettive che possono modificare l'assorbanza reale.

I parametri delle prestazioni ottiche, come il rumore fotometrico, l'accuratezza/ripetibilità della lunghezza d'onda, la ripetibilità fotometrica e la luce parassita, non sono influenzati dalla temperatura entro un intervallo di 10-40 °C.

Mentre i parametri ottici come la risoluzione fotometrica (rapporto toluene/esano) e le lunghezze d'onda dell'accuratezza fotometrica (K2Cr2O7 in HClO4) mostrano una dipendenza dalla temperatura che va da 0,014 a -0,034/unità nell'intervallo 10-40 °C.

Il controllo della temperatura per la spettrofotometria UV Vis può essere ottenuto utilizzando sistemi di termostatazione ad alte prestazioni come CuveT e CuvetteChanger. Per saperne di più, clicchi qui.

Che cos'è la luce diffusa?

Che cos'è la luce diffusa?

Perché lo scomparto del campione negli spettrofotometri UV vis array è aperto?

Lo scomparto del campione negli spettrofotometri UV Vis array è aperto perché gli strumenti array utilizzano l'ottica inversa e la rilevazione simultanea di tutte le lunghezze d'onda dello spettro uv/visibile.

Ottica inversa: La luce viene diffratta dopo aver attraversato il campione. Per questo motivo, solo una piccola frazione della luce ambientale esterna contribuisce al segnale in una determinata regione di lunghezza d'onda.

Rilevamento simultaneo: Utilizzando un rilevatore ad array che fornisce 2048 segnali di intensità luminosa contemporaneamente, lo spettro completo viene registrato in un secondo. Poiché la misurazione è molto veloce, l'effetto della luce ambientale è notevolmente ridotto.