La spettroscopia Uv Vis è una tecnica scientifica utilizzata per misurare la quantità di luce assorbita o trasmessa da un campione a diverse lunghezze d'onda della luce ultravioletta (uv) e visibile (vis).
Il processo prevede l'irradiazione di un fascio di luce UV Vis attraverso il campione e la misurazione della quantità di luce che lo attraversa. Analizzando il modello di assorbimento e trasmissione della luce, gli scienziati possono identificare e quantificare i componenti del campione.
Esiste una relazione unica tra la sostanza e il suo spettro uv-vis quando una sostanza assorbe il massimo della luce ad una specifica lunghezza d'onda. Questa relazione può essere utilizzata per:
Analisi qualitativa, cioè determinare la presenza di determinate sostanze.
Analisi quantitativa, cioè determinare le quantità di determinate sostanze.
La spettrofotometria UV Vis è comunemente utilizzata in molti campi della scienza, tra cui chimica, biologia e fisica, per studiare le proprietà dei materiali e le loro interazioni con la luce. È anche ampiamente utilizzata nell'industria per il controllo di qualità e l'analisi di materiali come farmaci, alimenti e cosmetici.
Questa pagina le fornirà le conoscenze essenziali sulla spettroscopia uv vis e le sue applicazioni.
Trovi le sue risposte sui fondamenti e le applicazioni uv vis nelle seguenti sezioni:
La spettroscopia Uv Vis è un tipo di spettroscopia di assorbimento in cui un campione viene illuminato con raggi elettromagnetici di varie lunghezze d'onda nei range uv-vis e uv-vis. A seconda della sostanza, i raggi di luce UV o visibile vengono parzialmente assorbiti dal campione. La luce rimanente, cioè la luce trasmessa , viene registrata in funzione della lunghezza d'onda da un rilevatore adatto. Il rilevatore produce quindi lo spettro uv-vis unico del campione (noto anche come spettro di assorbimento).
Per saperne di più sulle basi della spettroscopia uv vis, scarichi la guida METTLER TOLEDO "Applicazioni e fondamenti della spettrofotometria".
Quando la luce colpisce un oggetto, può essere assorbita dall'oggetto, in genere perché la lunghezza d'onda della luce assorbita corrisponde a un'eccitazione elettronica nell'oggetto. La luce rimanente viene trasmessa, cioè passa attraverso l'oggetto.
In uno spettofotometro, la trasmittanza viene misurata dividendo lo spettro di intensità della luce trasmessa attraverso un campione (I) per lo spettro di intensità della luce trasmessa attraverso il bianco (I0).
Convertitore Assorbanza/Trasmittanza
=
L'assorbanza (A), nota anche come densità ottica (OD), è la quantità di luce assorbita dall'oggetto e può essere espressa come segue
Trasmettitore (T)
Per approfondire le conoscenze fondamentali sulle tecniche di spettroscopia uv vis, scarichi la guida "Applicazioni e fondamenti della spettrofotometria".
Che cos'è la Legge di Beer-Lambert?
La Legge di Beer-Lambert afferma che la quantità di energia assorbita da una soluzione è proporzionale alla lunghezza del percorso e alla concentrazione. In parole povere, una soluzione più concentrata assorbe più luce di una soluzione diluita.
La dichiarazione matematica della legge di Beer è:
A = ϵ.d.c
Dove ϵ = assorbimenti molari, d = lunghezza del percorso e c = concentrazione. L'assorbibilità molare è una costante fisica unica del campione che si riferisce alla capacità del campione di assorbire la luce ad una determinata lunghezza d'onda. L'unità di misura ϵ è L-mol-1-cm-1.
Per saperne di più sulle basi della spettroscopia uv vis, scarichi la guida METTLER TOLEDO, "Applicazioni e fondamenti della spettrofotometria".
Qual è la differenza tra gli spettrofotometri a scansione e a schiera?
Uno spettrofotometro uv vis è uno strumento progettato per misurare l'assorbanza nella regione uv vis utilizzando la legge di Beer-Lambert. Misura l'intensità della luce che passa attraverso una soluzione campione in una cuvetta e la confronta con l'intensità della luce prima che passi attraverso il campione.
I componenti principali di uno spettrofotometro UV vis sono una sorgente di luce, un supporto per il campione, un dispositivo dispersivo per separare le diverse lunghezze d'onda della luce e un rilevatore adatto.
Spettrofotometro a scansione
Gli spettrofotometri a scansione convenzionali funzionano in base al principio di effettuare misurazioni consecutive della trasmittanza ad ogni lunghezza d'onda definita. La luce viene suddivisa in diverse lunghezze d'onda da una griglia di diffrazione. Una cuvetta campione viene posizionata tra la griglia di diffrazione e il rilevatore.
Spettrofotometro a raggiera
In uno spettofotometro array, il campione viene illuminato da un continuum, cioè da tutti i componenti spettrali della luce contemporaneamente, quindi assorbe la luce di diverse lunghezze d'onda contemporaneamente. La luce trasmessa viene poi diffratta da una griglia di riflessione. Questa strumentazione aiuta ad acquisire lo spettro uv-vis più velocemente di quanto si possa ottenere con uno spettrofotometro a scansione tradizionale.
Rispetto a uno spettrofotometro a scansione, uno spettofotometro ad array non ha parti mobili.
Per saperne di più, scarichi "Array contro scansione". Il libro bianco confronta le due configurazioni di spettrofotometro UV vis consolidate e ne valuta le prestazioni e i vantaggi.
Uno strumento uv vis deve funzionare secondo le sue specifiche per misurazioni UV Vis critiche, soprattutto nel controllo di qualità clinico, farmaceutico o industriale. Pertanto, la verifica delle prestazioni deve essere effettuata regolarmente. I risultati della calibrazione devono anche essere registrati e conservati.
Scarichi "Come i laboratori UV Vis dovrebbero effettuare la calibrazione uv vis dello spettrofotometro" per conoscere l'importanza della calibrazione in relazione alle revisioni del capitolo UV Vis presenti in Ph. Eur. 10 e USP42 NF37.
Parametri principali da tarare per uno spettrofotometro UV vis
I parametri principali da tarare per uno spettrofotometro UV vis sono riportati nella tabella seguente.
Test di prestazione
Materiale di riferimento certificato (CRM)
Strumento Parametro del test
Criteri di accettazione
USP 42 NF 37
Ph. Eur. 10
Accuratezza della lunghezza d'onda e
ripetibilità
Ho(ClO4)3: 4 % Ho2O3 in 10 % v/v HClO4
Vuoto: Aria
14 lunghezze d'onda
(240 nm - 650 nm)
Xe: 2 lunghezze d'onda (260,6, 528,6 nm)
UV (200 - 400 nm): ± 1 nm
Vis (400 - 780 nm): ± 2 nm
(S.D.) < 0,5 nm
UV (< 400 nm):
± 1 nm
Vis (> 400 nm):
± 3 nm
Fotometria
precisione e
ripetibilità**
K2Cr2O7 in 0,001 M HClO4
Bianco: 0,001 M HClO4
60 mg/L
0 A - 2 A,
235, 257, 313, 350 nm
Per l'assorbanza ≤ 1A
Precisione: ± 0,010A
Ripetibilità:
D.S. ≤ 0,005 A
Per assorbanza > 1A
Precisione: ± 1%
Ripetibilità:
S.D. ≤ 0,5%
Precisione: ± 0,010 A o ± 1 %, a seconda di quale dei due è maggiore
Acido nicotinico in
0,1 M HCl
Bianco: 0,1 M HCl
12 mg/L
0,26 A - 1,6 A
213, 261 nm
Linearità fotometrica
K2Cr2O7 in 0,001 M HClO4
Bianco: 0,001 M HClO4
6 - 200 mg/L, fino a 3,0 A,
235, 257, 313, 350 nm
Tutti i filtri misurati soddisfano i criteri di accettazione dell'accuratezza fotometrica
R2> 0,999
Acido nicotinico in
0,1 M HCl
Bianco: 0,1 M HCl
6 - 60 mg/L, fino a 2,5 A
213, 261 nm
Luce diffusa secondo la procedura A
(SFRM)
1,2 % w/v KCl/H2O;
Lunghezza del percorso 10 mm
Bianco: 1,2 % w/v KCl/H2O, lunghezza del percorso 5 mm
Amax a 198 nm
≥ 0.7 A
(NA)
Luce diffusa secondo la procedura B (SWM)
1,2 % w/v KCl/H2O;
Lunghezza del percorso 10 mm
Vuoto: H2O, lunghezza del percorso 10 mm
Amax a 198 nm
≥ 2.0 A
≥ 2.0 A
Risoluzione
0,02 % v/v toluene in n-esano
Bianco: n-esano/
n-eptano (Ph. Eur. 10)
Amax,269/Amin,267
>1.3
I livelli sono indicati nella rispettiva monografia
** Nessuna specifica della ripetibilità fotometrica (precisione) in Ph. Eur.
S.D. - Deviazione standard
3. La scienza dei colori
I fondamenti delle misurazioni del colore
I colori rendono il nostro mondo più interessante. Quando vediamo un oggetto, la luce riflessa dall'oggetto entra nei nostri occhi e viene raccolta da diversi tipi di fotorecettori nella retina. A seconda della sensibilità dei fotorecettori, persone diverse possono percepire lo stesso colore in modo diverso.
Per accettare universalmente la precisione di un colore specifico, è necessario assegnare dei valori numerici. In breve, le apparecchiature di misurazione come gli spettrofotometri e i colorimetri forniscono i risultati del colore come valori, per garantire l'accuratezza e la ripetibilità della determinazione del colore.
Gli spettrofotometri quantificano i dati del colore raccogliendo e filtrando le lunghezze d'onda trasmesse attraverso un campione. Un'equazione matematica viene applicata ai dati spettrali per mappare il colore su una bilancia cromatica.
La bilancia dei colori CIE (Commission internationale de l'éclairage) è definita utilizzando tre parametri: tinta, croma e luminosità.
Latinta è il colore dominante di un oggetto. I colori primari e secondari combinati formano la tinta.
Ilcroma, noto anche come saturazione, descrive la vivacità o l'opacità di un colore.
Laluminosità è l'intensità luminosa del colore (se è scuro o chiaro).
Ogni sistema di colori CIE utilizza tre coordinate per localizzare un colore su una bilancia. Le tre bilance cromatiche principali sono Tristimulus CIE XYZ, CIE L*a*b* e CIE L*u*v*.
Ad esempio, quando un colore è espresso in CIE L*a*b*:
L* definisce la luminosità
a* indica il valore rosso/verde
b* indica il valore di giallo/blu
Utilizzando la bilancia dei colori CIE L*a*b*, le coordinate per il rosso della rosa raffigurata sarebbero:
L* = 29.00, a* = 52.48, b* = 22.23
Per saperne di più sulle basi della misurazione del colore, scarichi la guida.
Il colore è un fattore chiave per il riconoscimento immediato.
Offrire ai consumatori un'esperienza visiva complessiva di successo può influenzare la decisione di acquisto. Pertanto, il colore è importante nella definizione dell'identità del marchio e della coerenza del prodotto.
Per definire in modo univoco un prodotto secondo le bilance industriali, vengono stabilite diverse bilance di colori. Queste bilance includono:
Bilance
Standard
Applicazioni
Saybolt
ASTM D156, ASTM D6045
Per determinare se il carburante (cherosene, benzina, diesel, nafta, ecc.) è contaminato o si è degradato durante lo stoccaggio.
APHA/Pt-Co/Hazen
ASTM D1209
Indice di giallo utilizzato come metro per i controlli di purezza nell'industria idrica, chimica, petrolifera e delle materie plastiche.
Gardner
ASTM D1544/D6166, DIN EN ISO 4630-2
Per testare prodotti come le resine, gli acidi grassi, le vernici e gli oli essiccanti che hanno raggiunto il colore attraverso il riscaldamento.
CIELAB
DIN EN 11664-4, DIN 5033-3, 4630, ASTM Z 58.7.1 DIN 6174
Controllo di qualità per l'industria degli aromi e dei profumi e per l'industria alimentare e delle bevande
Metodo MEBAK 2.13.2, Metodo EBC 8.5, Metodo EBC 9.6
Per misurare l'intensità del colore e la torbidità (foschia) in unità EBC di birra, malti, caramello, ecc.
USP/EUP
USP-24 Monografia 631, metodo EP 2.2.2
Controllo di qualità dei farmaci
Hess-Ives
Metodo di prova DGK F 050.2
Utilizzato per testare prodotti chimici e liquidi tensioattivi (soprattutto nell'industria cosmetica)
4. Analisi dei microvolumi con uno spettrofotometro uv vis
Come eseguire l'analisi del microvolume nella spettroscopia uv vis?
Uno spettofotometro a microvolume misura volumi di campione fino a 1 µl. La concentrazione di acidi nucleici in un campione è solitamente dell'ordine di nano o microgrammi per millilitro.
Diluire tali microvolumi e ottenere risultati accurati è impegnativo. Pertanto, la microanalisi senza diluizione diventa importante per l'analisi a valle degli acidi nucleici.
Durante l'analisi degli acidi nucleici, il campione in microvolumi viene pipettato nello scomparto fine sulla superficie del piedistallo. Il fascio di luce dalla sorgente della lampada viene guidato dalla fibra ottica verso la piattaforma del micro-volume. Poiché la lunghezza del percorso è ridotta all'ordine di un millimetro, è possibile analizzare con precisione concentrazioni più elevate di analita senza diluizioni multiple.
Un sistema a microvolumi utilizza la tecnologia a fibre ottiche insieme alle proprietà intrinseche del campione (come la tensione superficiale) per trattenere il campione sulla piattaforma del piedistallo e determinare l'assorbanza in tempo reale dei campioni a bassi volumi.
Grazie a questi vantaggi, l'analisi in microvolume diventa una scelta ideale per l'analisi biomolecolare.
Partecipi al webinar on-demand "Massimizzare l'accuratezza del flusso di lavoro attraverso le buone pratiche uv/vis nelle analisi dell'acido nucleico" per ottenere suggerimenti e trucchi sull'analisi in microvolume.
Controllo di qualità degli acidi nucleici La quantificazione degli acidi nucleici è un metodo pre-analitico essenziale per ottenere risultati accurati e affidabili in molti saggi di biologia molecolare, come il sequenziamento di nuova generazione (NGS), la reazione a catena della polimerasi (PCR), la PCR in tempo reale (PCR quantitativa; qPCR), la clonazione e la trasfezione.
Il controllo qualitativo e quantitativo degli acidi nucleici può essere eseguito determinando la purezza e la concentrazione degli acidi nucleici.
Metodi di analisi del DNA A260 fornisce la correlazione della concentrazione di nucleotidi e A280 quella delle proteine residue. Gli aminoacidi tirosina e triptofano assorbono a 280 nm e la fenilalanina assorbe bene a 260 nm. Ciò consente di calcolare il rapporto A260/A280 per la purezza del DNA, utilizzando misurazioni dirette dell'assorbanza. Il DNA di buona qualità avrà un rapporto A260/A280 di 1,7-2,0.
Saggi di quantificazione delle proteine I diversi metodi di quantificazione delle proteine totali includono i saggi A280, acido bicinchoninico (BCA), Bradford, Lowry, Pierce e altri nuovi saggi. Le proteine in soluzione hanno dei massimi a 280 nm dovuti agli aminoacidi con anelli aromatici e dei minimi a circa 220 nm dovuti alla presenza di legami peptidici.
La concentrazione viene calcolata utilizzando la formula di Warburg:
Concentrazione proteica (mg/ml) = 1,55 X (lettura A280) - 0,76 X (lettura A260)
Per saperne di più sull'analisi del DNA con la spettroscopia uv vis, scarichi l'editoriale dell'applicazione "Rapporto 260/280: Indicatore della contaminazione proteica".
Quali sono gli errori comuni nelle misurazioni e nella calibrazione uv vis?
Una buona accuratezza e precisione nelle misurazioni UV Vis può essere raggiunta prendendo precauzioni per evitare errori. I rischi di errore tipici che devono essere tenuti in considerazione quando si effettuano le misurazioni UV Vis includono:
Caratteristiche spettrali. La caratterizzazione spettrale viene eseguita durante il processo di calibrazione. I fattori principali che possono portare a risultati errati sono l'accuratezza della lunghezza d'onda, la larghezza di banda spettrale, la luce parassita e la linearità.
Caratteristiche fotometriche. Le caratteristiche fotometriche includono la sensibilità spettrale della sorgente luminosa, la sensibilità dipendente dalla temperatura della sorgente luminosa e del rilevatore, ecc.
Interazioni ottiche. Le radiazioni della sorgente luminosa possono interagire con il materiale della cuvetta, alterando l'intensità dell'assorbanza del campione. Tali interazioni ottiche possono essere evitate selezionando il giusto materiale della cuvetta.
Fattori vari. Anche altri fattori come la temperatura, le fluttuazioni della tensione di linea, le vibrazioni, la contaminazione o il riscaldamento del campione da parte del fotometro influiscono negativamente sulle misurazioni.
GUVP™
Anche se non tutti gli errori possono essere evitati, è possibile ridurli al minimo per ottenere risultati migliori.
Scarica l'opuscolo Buona prassi UV/vis "Risultati affidabili per la spettroscopia uv-vis".
La scelta della cuvetta giusta implica la selezione del materiale giusto e della dimensione corretta in base al campione e alla strumentazione.
Il materiale della cuvetta deve avere una trasmissione sufficiente a una determinata lunghezza d'onda. L'attenuazione della luce sulle pareti della cuvetta non deve influenzare il risultato dell'analisi. Le cuvette di vetro non sono utilizzate nella regione UV per le analisi al di sotto dei 370 nm, poiché assorbono la radiazione. Si raccomanda di utilizzarle solo nella regione del visibile.
La tabella che segue indica gli intervalli di trasmissione utilizzabili delle cuvette:
Materiale
Intervallo di trasmissione teorico (nm)
Quarzo UV lontano
170-2700
Vetro ottico
320-2500
Quarzo vicino all'IR
220-3800
Silice UV
220-2500
Plastica UV
220-900
Cella PS monouso
340-750
Cella PMMA monouso
285-750
Anche le dimensioni delle cuvette influiscono sulle capacità di misurazione. La lunghezza nominale del percorso di radiazione della cuvetta è di 10 mm. A seconda dei campioni, la lunghezza può variare da 1 mm a 100 mm.
Le cuvettestandard possono essere utilizzate per la maggior parte dei campioni da studiare. Le comuni cuvette per assorbimento e fluorescenza hanno una base esterna di 12,5 mm x 12,5 mm, un'altezza di 45 mm e dimensioni interne di 10 mm x 10 mm.
Le cuvette apercorso lungo (cuvette con una lunghezza di percorso superiore a 10 mm) sono utilizzate quando il campione è troppo diluito o il campione vaporizza o subisce un cambiamento chimico durante il processo di misurazione.
Le cuvette apercorso breve (cuvette con una lunghezza di percorso inferiore a 10 mm) sono utilizzate quando l'assorbanza è elevata e la diluizione è difficile.
Come maneggiare correttamente le cuvette?
Quando maneggia le cuvette, le porti sempre con i lati smerigliati. Eviti di toccare le superfici ottiche trasparenti con le dita, in quanto le impronte digitali possono causare un'assorbanza significativa e quindi influire sulla precisione.
Eviti di usare pipette pasteur in vetro per riempire la cuvetta, perché potrebbero graffiare la superficie ottica causando ulteriori interferenze. Si consigliano pipette con puntali di plastica monouso.
La pulizia delle cuvette ha un effetto importante sui risultati, quindi dobbiamo considerarla un fattore molto importante.
Per una pulizia profonda delle cuvette al quarzo, si consigliano i seguenti passaggi:
Immergere le cuvette nella soluzione detergente.
Rimuovere la soluzione detergente e sciacquare le cuvette con acqua deionizzata.
Lavare le cuvette con etanolo o acetone, tranne nei casi di proteine (vedere la tabella sottostante).
Asciughi le cuvette strofinandole con un tessuto privo di lanugine, seguito da un'asciugatura all'aria o in forno di essiccazione.
Il grafico che segue indica gli intervalli di trasmissione utilizzabili delle cuvette.
Soluzioni acquose
Molecole organiche
Particelle difficili da rimuovere
Proteine
Metalli pesanti
Acidi grassi
Soluzioni di pulizia
Parti uguali in volume di HCl 3 M ed etanolo
Lavaggio con acido nitrico al 50%
HNO concentrato3 o 2 M HCl
Parti uguali in volume di etanolo e 3 M HCl
Incubare a temperatura ambiente con tripsina
(L'etanolo e l'acetone non sono consigliati per la pulizia).
Parti uguali in volume di acido solforico 2 M e acqua deionizzata al 50%.
Aqua regia
Parti uguali in volume di IPA e acqua deionizzata
Tempo di immersione*
10 minuti
10 minuti
30 secondi
Per tutta la notte
20 minuti
Asciugare
*Il tempo di immersione indicato nella tabella è una stima approssimativa; tuttavia, si raccomanda di immergere le cuvette solo finché le macchie/contaminanti non vengono rimosse.
Le cuvette di vetro possono essere pulite sciacquando le cuvette con acetone o etanolo, seguito da un risciacquo con acqua. Si raccomanda l'asciugatura all'aria.
Le cuvette di plastica possono essere lavate più volte con acqua deionizzata. Non è consigliabile lavare le cuvette di plastica con prodotti chimici.
Scarichi la nostra collezione di poster con suggerimenti e trucchi per mantenere puliti i suoi strumenti di laboratorio.
Buone pratiche per l'uso degli spettrofotometri a micro volumi
Preparare il campione La sensibilità dello strumento può essere bassa per le concentrazioni diluite dei campioni biologici. Per aumentare la sensibilità di tali campioni, si consideri di prelevare una concentrazione più elevata del campione. Le misurazioni del micro volume richiedono in genere 1-2 µl di volume di campione. Utilizzi delle pipette calibrate per prelevare il campione. Bisogna fare attenzione a preparare e prelevare un campione omogeneo per l'analisi.
Pulire la piattaforma per micro volumi Assicurarsi che la superficie del piedistallo per micro volumi e lo specchio siano puliti correttamente. È sufficiente pulire le superfici con un tessuto privo di pelucchi, utilizzando acqua deionizzata. Se si utilizza una soluzione tampone, detergenti o un campione appiccicoso, pulire la superficie più volte prima di procedere con il campione successivo.
Posizionare il campione sulla piattaforma Lentamente e costantemente, posizionare il campione sulla superficie per evitare la formazione di bolle.
Lavorare entro i limiti di rilevamento Conoscere i limiti di rilevazione più bassi e più alti dello strumento e lavorare entro tale intervallo.
Pratiche generali per misurazioni accurate di uv vis.
Faccia attenzione durante la preparazione del campione e il pipettaggio in una cuvetta o su una piattaforma per microvolumi. Il campione deve essere omogeneo.
Se nel campione sono presenti particelle solide in sospensione, la luce potrebbe diffondersi. In questi casi, filtrare il campione con un filtro a siringa.
Riempire il campione in una cuvetta tenendo conto della dimensione z del portacampioni. In questo modo si assicura che la luce passi attraverso il campione. La dimensione z è la distanza dal fondo di una cuvetta all'altezza in cui il fascio di luce passa attraverso il campione.
Prima di ogni misurazione, pulisca la cuvetta con un tessuto privo di pelucchi. Utilizzi ogni volta un nuovo tessuto.
Utilizzi lo stesso solvente/tampone di soluzione che è stato usato per la preparazione del campione come bianco.
6. Quali sono le applicazioni della spettroscopia uv vis nei vari settori?
La spettroscopia uv vis è una tecnica analitica versatile con un'ampia gamma di applicazioni in vari settori. Alcune delle applicazioni significative della spettroscopia uv vis in diversi settori sono:
Alimenti e bevande
La spettroscopia uv vis determina la qualità e la composizione dei prodotti alimentari e delle bevande. Può essere utilizzata per analizzare il colore (ad esempio, del vino), il sapore e l'aroma dei prodotti alimentari, nonché per rilevare la presenza di contaminanti o adulteranti.
Prodotti farmaceutici
La spettroscopia uv vis analizza la purezza, la concentrazione e l'identità di farmaci e altri prodotti farmaceutici. Viene anche utilizzata per monitorare la stabilità dei prodotti farmaceutici nel tempo.
Cosmetici
Valutazione della fotostabilità degli agenti per le formulazioni, caratterizzazione delle particelle dell'agente bloccante UV, valutazione dell'indice di colore, rilevamento dell'adulterazione (industria dei profumi), studio delle proprietà ottiche, quantificazione di coloranti, antiossidanti, ecc.
Petrolchimico
Caratterizzazione del petrolio greggio, calcolo delle frazioni di asfaltene, formulazione di indici per il contenuto aromatico, qualità della gravità del petrolio greggio, contenuto di zolfo, calcolo del fattore di solubilità di Hildebrand (esteso a bitume, oli pesanti e di scisto e oli provenienti da cracking catalitico fluido, coking o liquefazione del carbone).
Chimica
Determinazione delle proprietà chimiche, valutazione della qualità finale del prodotto finito, studio della composizione dei polimeri, qualificazione delle acque reflue, determinazione della purezza e dell'efficienza della tintura, degradazione fotocatalitica dei polimeri/delle tinture, residui di pesticidi nel suolo o nell'acqua.
Biotecnologia
Concentrazione e purezza di acido nucleico, proteine (A280, BCA, Biureto, Bradford Lowry, OD 600), misurazioni di colture cellulari microbiche, denaturazione di proteine, studi cinetici (attività enzimatica), campioni biologici come sangue, plasma, siero, ecc.
METTLER TOLEDO offre un'ampia gamma di metodi di applicazione convalidati. Trovi l'applicazione più adatta alle sue esigenze attraverso il nostro motore di ricerca online.
Le diverse tecniche spettroscopiche si differenziano principalmente in base alla radiazione utilizzata, all'interazione tra l'energia e il materiale, al tipo di materiale e alle applicazioni per cui vengono utilizzate. Le tecniche spettroscopiche comunemente utilizzate per l'analisi chimica sono la spettroscopia atomica, la spettroscopia ultravioletta e visibile (uv vis), la spettroscopia a infrarossi, la spettroscopia Raman e la risonanza magnetica nucleare.
Tipo di spettroscopia
Tipo di radiazione
Interazioni
Lunghezza d'onda
Spettroscopia dei raggi ϒ
Raggi ϒ
Nuclei atomici
< 0,1 nm
Spettroscopia di fluorescenza a raggi-X
Raggi-X
Elettroni del guscio interno
0,01 - 2,0 nm
Spettroscopia uv sotto vuoto
Ultravioletto (UV)
Ionizzazione
2,0 - 200 nm
Spettroscopia uv vis
Uv Vis
Elettroni di valenza
200 - 800 nm
Spettroscopia a infrarossi e Raman
Infrarossi
Vibrazioni molecolari
0,8 - 300 mm
Spettroscopia a microonde
Microonde
Rotazioni molecolari
Da 1 mm a 30 cm
Spettroscopia di risonanza di spin di elettroni
Spin degli elettroni
Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare
Onde radio
Spin nucleare
0.6 - 10 m
Quali sono le diverse interazioni molecolari nella regione UV?
L'assorbimento della luce UV determina transizioni elettroniche da livelli energetici inferiori a livelli energetici superiori. L'assorbimento dei raggi ultravioletti nelle molecole organiche è limitato a determinati gruppi funzionali (cromofori) che contengono elettroni di valenza a bassa energia di eccitazione. Le transizioni/interazioni molecolari che avvengono a causa dell'assorbimento UV sono:
π- π* (transizione da pi greco a pi greco stellare) - orbitale di legame a orbitale di antilegame
n - π* (transizione da n a pi stella) - orbitale di non legame a orbitale di non legame.
Queste transizioni richiedono un gruppo insaturo nella molecola per fornire gli elettroni π.
Le transizioni da σ (legame) a σ* (antilegame) richiedono un'energia più elevata e quindi non possono essere rilevate con la spettroscopia uv-vis.
In che modo i gruppi funzionali influenzano gli spettri?
Consideriamo un gruppo funzionale contenente atomi con una o più coppie di elettroni solitari che non assorbono le radiazioni ultraviolette/visibili. Tuttavia, quando questo gruppo funzionale è collegato a un cromoforo, altera l'intensità e la lunghezza d'onda dell'assorbimento. Questo fenomeno si chiama auxocromo o gruppo di potenziamento del colore.
La presenza di un auxocromo provoca lo spostamento di posizione di un picco o di un segnale verso una lunghezza d'onda maggiore, che si chiama batocromia o spostamento verso il rosso. I gruppi funzionali che contribuiscono ai gruppi batocromici sono i substituenti come metile, idrossile, alcossi, alogeni e gruppi amminici.
L'auxocromo che provoca lo spostamento della posizione di un picco o di un segnale verso una lunghezza d'onda inferiore è chiamato ipocromico o blue shift. In realtà, la combinazione di cromoforo e auxocromo si comporta come un nuovo cromoforo che ha un massimo di assorbimento diverso (λmax). Ad esempio, il benzene mostra λmax a 256 nm, mentre l'anilina mostra λmax a 280 nm. Quindi, il gruppo NH2 agisce come un auxocromo e provoca lo spostamento di λmax a un valore maggiore.
Qual è la differenza tra larghezza di banda spettrale e risoluzione nella spettroscopia uv vis?
La larghezza di banda spettrale (SBW) di uno spettofotometro è legata alla larghezza fisica della fessura e alla dispersione ottica del sistema monocromatore. La risoluzione è la capacità di uno strumento di separare la luce in regioni di lunghezza d'onda finite e distinte e di distinguere ciascuna regione finita. La larghezza di banda spettrale è tipicamente utilizzata per gli strumenti a scansione, mentre la risoluzione è tipicamente utilizzata per gli strumenti ad array.
Per la maggior parte degli scopi quantitativi della farmacopea, è sufficiente una larghezza di banda spettrale inferiore a 2 nm e il criterio di accettazione per il rapporto è 1,3. La risoluzione spettrale può essere utilizzata per il confronto con la larghezza di banda spettrale.
La tabella mostra la risoluzione degli spettrofotometri uv/vis Excellence di METTLER TOLEDO, misurata utilizzando toluene in esano, e l'equivalente SBW.
Strumento
Risoluzione spettrale
SBW equivalente (nm)
UV5
> 1.5
< 2.0
UV5Bio
> 1.5
< 2.0
UV5Nano
> 1.7
< 1.5
UV7
> 1.9
≤ 1.0
Quali sono le diverse sorgenti luminose utilizzate in uno spettrofotometro UV vis?
La migliore sorgente luminosa è quella che fornisce una buona intensità con un basso rumore in tutte le lunghezze d'onda ultraviolette e visibili e che offre stabilità per un lungo periodo. Esiste una gamma di sorgenti luminose che vengono comunemente impiegate, come indicato di seguito.
Sorgente luminosa
Gamma di lunghezza d'onda
(nm)
Regione
Durata di vita
Lampada a filamento di tungsteno
350 - 2500
VIS + IR
3.000 ore
Lampada ad arco di deuterio
190 - 400
UV
1.000 ore
Lampada a idrogeno
190 - 400
UV
1.000 ore
Lampada flash allo xeno
190 - 1100
UV + VIS + NIR
5.500 ore*
* Corrisponde a 50 Hz di flash a funzionamento costante
In che modo il reticolo di diffrazione è migliore di un prisma?
I prismi e i reticoli di diffrazione sono elementi dispersivi tipici. Un prisma ottiene la dispersione grazie alla differenza dell'indice di rifrazione del materiale in base alla lunghezza d'onda. Tuttavia, un reticolo di diffrazione utilizza la differenza nella direzione di diffrazione per ogni lunghezza d'onda a causa dell'interferenza. Sia i prismi che i reticoli di diffrazione possono suddividere gli spettri luminosi in molti colori per l'analisi. Tuttavia, un reticolo di diffrazione è meno sensibile al colore della luce e può essere realizzato per diffondere i colori su un angolo più ampio rispetto a un prisma. Il vetro di un prisma è trasparente alla luce visibile, ma assorbe e blocca la luce nella parte infrarossa e ultravioletta dello spettro. Una griglia di diffrazione con alcune centinaia di linee per pollice può deviare la luce nel mezzo dello spettro visibile di almeno 20 gradi. L'angolo di deflessione di un prisma di vetro è generalmente molto più piccolo di questo.
Quali composti inorganici possono essere misurati con la spettroscopia uv vis?
Le molecole possono essere analizzate con la spettroscopia uv vis se possiedono un gruppo funzionale o una coniugazione, oppure se producono un complesso di colore. Poiché i composti inorganici non contengono alcun gruppo funzionale o coniugazione, il metodo comune per analizzarli è la reazione con un composto adatto. Questo produce un complesso colorato la cui assorbanza può essere misurata fotometricamente nella regione del visibile e correlata alla sua concentrazione effettiva. Ad esempio, il ferro viene comunemente analizzato mediante una reazione con 1, 10-fentrolina per produrre un complesso di colore rosso. L'assorbanza del complesso viene misurata a 570 nm per stimare la concentrazione di ferro.
In cosa differiscono gli spettrofotometri a singolo raggio e a doppio raggio?
La differenza principale tra uno spettrofotometro a singolo raggio e uno a doppio raggio è la seguente.
Spettrofotometro a singolo raggio: Un singolo raggio proveniente dalla sorgente luminosa attraversa il campione.
Spettrofotometro a doppio raggio: Il fascio di luce proveniente dalla sorgente luminosa viene diviso in due parti: una parte passa attraverso il campione e l'altra passa attraverso il riferimento.
La divisione del fascio in uno spettofotometro a doppio raggio si ottiene in due modi:
in modo statico, con specchi parzialmente trasmittenti o un dispositivo simile
attenuando i fasci con dispositivi ottici e meccanici in movimento
Come analizzare un film polimerico solido utilizzando l'uv-vis?
L'analisi di un campione solido viene eseguita principalmente stimando la sua assorbanza, trasmittanza e riflettanza. I parametri comuni determinati per i polimeri solidi includono la % di trasmittanza, la lunghezza d'onda di taglio e l'indice di giallo. Il campione viene montato su un supporto appositamente progettato per i campioni solidi e le letture vengono effettuate nello stesso modo in cui vengono effettuate per i campioni liquidi. Un supporto per campioni solidi consente di misurare campioni solidi come pellicole o vetro.
La temperatura influisce sull'analisi uv vis?
La temperatura influisce sui valori di assorbanza. I diversi solventi subiscono interazioni diverse a temperature diverse. I parametri della soluzione che cambiano a causa delle variazioni di temperatura sono:
Velocità di reazione. La velocità cambia quando la temperatura è elevata. Questo può causare un cambiamento nell'attività del campione. Le reazioni enzimatiche/biomolecolari sono molto sensibili alla temperatura.
Solubilità di un soluto. La solubilità è influenzata dalle variazioni di temperatura. Una scarsa solubilità può provocare un assorbimento impreciso.
Espansione o contrazione del solvente. Questo può portare a una variazione della concentrazione della soluzione e influenzare l'assorbanza, in quanto l'assorbanza è linearmente correlata alla concentrazione.
Effetto Schlieren. Questo effetto può verificarsi con le variazioni di temperatura, determinando una serie di correnti convettive che possono modificare l'assorbanza reale.
I parametri delle prestazioni ottiche, come il rumore fotometrico, l'accuratezza/ripetibilità della lunghezza d'onda, la ripetibilità fotometrica e la luce parassita, non sono influenzati dalla temperatura entro un intervallo di 10-40 °C.
Mentre i parametri ottici come la risoluzione fotometrica (rapporto toluene/esano) e le lunghezze d'onda dell'accuratezza fotometrica (K2Cr2O7 in HClO4) mostrano una dipendenza dalla temperatura che va da 0,014 a -0,034/unità nell'intervallo 10-40 °C.
Il controllo della temperatura per la spettrofotometria UV Vis può essere ottenuto utilizzando sistemi di termostatazione ad alte prestazioni come CuveT e CuvetteChanger. Per saperne di più, clicchi qui.
Che cos'è la luce diffusa?
La luce parassita è definita come la luce che raggiunge il rilevatore e che non proviene dalla sorgente luminosa dello strumento e non segue il percorso ottico, causando una deviazione alla lunghezza d'onda corrispondente. Pertanto, l'intensità luminosa misurata dal rilevatore è più alta di quella che dovrebbe essere. Al contrario, questo significa anche che l'assorbanza misurata è inferiore alla vera assorbanza, perché è ridotta dal contributo della luce parassita. Questo effetto è più evidente ai valori di assorbanza più elevati (alte concentrazioni di campione).
Scarichi il whitepaper per saperne di più sull'origine e sulla misurazione accurata della luce parassita:
Perché lo scomparto del campione negli spettrofotometri UV vis array è aperto?
Lo scomparto del campione negli spettrofotometri UV Vis array è aperto perché gli strumenti array utilizzano l'ottica inversa e la rilevazione simultanea di tutte le lunghezze d'onda dello spettro uv/visibile.
Ottica inversa: La luce viene diffratta dopo aver attraversato il campione. Per questo motivo, solo una piccola frazione della luce ambientale esterna contribuisce al segnale in una determinata regione di lunghezza d'onda.
Rilevamento simultaneo: Utilizzando un rilevatore ad array che fornisce 2048 segnali di intensità luminosa contemporaneamente, lo spettro completo viene registrato in un secondo. Poiché la misurazione è molto veloce, l'effetto della luce ambientale è notevolmente ridotto.
Applicazioni
Scarichi le guide alle applicazioni specifiche per la spettroscopia uv vis qui di seguito.
