UV/VIS-Spektroskopie

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UV/VIS-Spektroskopie
UV/VIS-Spektrum
Was ist UV/VIS-Spektroskopie?

Umrechnung von Absorption/Transmission

=

Lichtabsorption nach dem Lambert-Beer'schen Gesetz
Scannende Spektralphotometer
Scannende Spektralphotometer

Das Funktionsprinzip eines herkömmlichen scannenden Speketrometers basiert auf der fortlaufenden Messung des Transmissionswerts bei jeder definierten Wellenlänge. Das Licht wird durch ein Beugungsgitter in verschiedene Wellenlängen aufgespalten. Eine Probenküvette wird wischen Beugungsgitter und Detektor platziert.

Array-Spektralphotometer
Array-Spektralphotometer

In einem Array-Spektrometer wird die Probe von einem Kontinuum beleuchtet, d. h. von allen spektralen Komponenten auf einmal, und absorbiert somit gleichzeitig Licht verschiedener Wellenlängen. Das Durchlicht wird dann von einem Reflexionsgitter gebrochen. Mit diesem Instrument kann das UV/VIS-Spektrum schneller erfasst werden als mit einem herkömmlichen scannenden Spektrometer.

Array- und scannende UV/VIS-Spektroskopie im Vergleich

Leistungstest

Zertifiziertes Referenzmaterial (CRM)

Instrumentenprüfparameter

Akzeptanzkriterien

USP42-NF37

Ph. Eur. 10

Wellenlängengenauigkeit und

-wiederholbarkeit

Ho (ClO4)3: 4 % Ho2O3 in 10 % v/v HClO4

Blindwert: Luft

14 Wellenlängen

(240 nm – 650 nm)

Xe: 2 Wellenlängen (260,6, 528,6 nm)

UV (200 – 400 nm): ± 1 nm

VIS (400 – 780 nm): ± 2 nm

(S.D.) < 0,5 nm

UV (< 400 nm):

± 1 nm

VIS (> 400 nm):

± 3 nm

Photometrische

Genauigkeit und

Wiederholbarkeit**

K2Cr2O7 in 0,001  M HClO4

Blindwert: 0,001 M HClO4

60 mg/l

0 A – 2 A,

235, 257, 313, 350 nm

Bei Absorption ≤ 1 A

Genauigkeit: ± 0,010 A

Wiederholbarkeit:

S.D.  ≤ 0,005 A

 

Bei Absorption > 1 A

Genauigkeit: ± 1 %

Wiederholbarkeit:

S.D.  ≤ 0,5 %

 

Genauigkeit: ± 0,010 A oder ± 1 %, je nachdem, was grösser ist

 

Nikotinsäure in

0,1 M HCl

Blindwert: 0,1 M HCl

12 mg/l

0,26 A – 1,6 A

213, 261 nm

Photometrische Linearität

K2Cr2O7 in 0,001  M HClO4

Blindwert: 0,001 M HClO4

 

6 – 200 mg/l, bis zu 3,0 A,

235, 257, 313, 350 nm

Alle gemessenen Filter erfüllen die  photometrischen Genauigkeitskriterien

R2> 0,999

Nikotinsäure in

0,1 M HCl

Blindwert: 0,1 M HCl

6 – 60 mg/l, bis zu 2,5 A

213, 261 nm

Streulicht entsprechend Verfahren A

(SFRM)

1,2 % w/v KCl/H2O;

10 mm Pfadlänge

Blindwert:: 1,2 % w/v KCl/H2O, 5 mm Pfadlänge

Amax bei 198 nm

≥ 0,7 A

(n. z.)

Streulicht entsprechend Verfahren B (SWM)

1,2 % w/v KCl/H2O;

10 mm Pfadlänge

Blank: H2O, 10 mm Pfadlänge

Amax bei 198 nm

≥ 2,0 A

≥ 2,0 A

Auflösung

0,02 % v/v Toluol in n-Hexan

Blindwert: n-Hexan/

n-Heptan (Ph. Eur. 10)

Amax,269/Amin,267

> 1,3

Werte sind in den jeweiligen Monografien angegeben

** Keine Angabe der photometrischen Wiederholbarkeit (Präzision) in der Ph. Eur.

S.D. – Standardabweichung

Grundlagen der UV/VIS-Farbmessung
Farbzahlen
Welche Farbe hat diese Rose?

Verschiedene Farbskalen werden eingerichtet, um ein Produkt nach Industriestandards eindeutig zu definieren. Zu diesen Farbskalen zählen:

Skala

Standard

Anwendungen

Saybolt

ASTM D156, ASTM D6045

Um festzustellen, ob Kraftstoff (Kerosin, Benzin, Diesel, Naphtha usw.) verunreinigt ist oder sich bei der Lagerung zersetzt hat

APHA/Pt-Co/Hazen

ASTM D1209

Gelbheitsindex als Mass für Reinheitsprüfungen in der Wasser-, Chemie-, Öl- und Kunststoffindustrie

Gardner

ASTM D1544/D6166, DIN EN ISO 4630-2

Zur Prüfung von Produkten wie Harzen, Fettsäuren, Lacken und Trockenölen, die durch Erhitzen Farbe angenommen haben

CIELAB

DIN EN 11664-4, DIN 5033-3, 4630, ASTM Z 58.7.1, DIN 6174

Qualitätskontrolle für die Aroma- und Duftstoff- sowie für die Lebensmittel- und Getränkeindustrie

CIELab Farbmessung – UV/VIS- Spektroskopie

EBC

MEBAK-Methode 2.13.2, EBC-Methode 8.5, EBC-Methode 9.6

Zur Messung der Farbintensität und Trübung in EBC-Einheiten von Bier, Malz, Karamell usw.

USP/EUP

USP-24-Monographie 631, EP-Methode 2.2.2

Qualitätskontrolle von Arzneimitteln

Hess-Ives

DGK-Testmethode F 050.2

Zum Prüfen von Chemikalien und Tensidflüssigkeiten (hauptsächlich in der Kosmetikindustrie)

 

Qualitätskontrolle von Nukleinsäuren
Küvetten für die UV/VIS-Analyse

Der folgenden Tabelle können Sie die nutzbaren Transmissionsbereiche von Küvetten entnehmen:

Material

Theoretischer Transmissionsbereich (nm)

Fern-UV-Quarzglas

170 – 2 700

Optisches Glas

320 – 2 500

Nahinfrarot-Quarzglas

220 – 3 800

UV-Silica

220 – 2 500

UV-Kunststoff

220 – 900

Einweg-PS-Zelle

340 – 750

Einweg-PMMA-Zelle

285 – 750

 

Küvette für UV/VIS-Spektroskopie

 

Wässrige Lösungen

Organische Moleküle

Schwer zu entfernende Partikel

Proteine

Schwermetalle

Fettsäuren

Reinigungslösungen

Gleiche Volumenanteile 3 M HCl und Ethanol

 

Waschen mit 50 % Salpetersäure

Konzentrierte HNO3 oder 2 M HCl

Gleiche Volumenanteile Ethanol und 3 M HCl

 

 

Inkubieren bei Raumtemperatur mit Trypsin

 

(Ethanol und Aceton werden zur Reinigung nicht empfohlen.)

Gleiche Volumenanteile Schwefelsäure 2 M und 50 % entionisiertes Wasser

 

Königswasser

 

 

Gleiche Volumenanteile IPA und entionisiertes Wasser

Einwirkzeit*

10 Minuten

10 Minuten

30 Sekunden

Über Nacht

20 Minuten

Abwischen

*Die in der Tabelle angegebene Einwirkzeit ist eine grobe Schätzung. Es wird jedoch empfohlen, Küvetten nur so lange zu behandeln, bis die Flecken/Verunreinigungen entfernt sind.

UV/VIS-Spektroskopie in der Lebensmittelindustrie
UV/VIS-Spektroskopie in der Pharmaindustrie
UV/VIS-Spektroskopie in der Kosmetikindustrie
UV/VIS-Spektroskopie in der petrochemischen Industrie
UV/VIS-Spektroskopie in der chemischen Industrie
UV/VIS-Spektroskopie in der Biotechnologie

Welche Arten der Spektroskopie gibt es?

Die verschiedenen spektroskopischen Verfahren unterscheiden sich hauptsächlich durch die verwendete Strahlung, die Wechselwirkung zwischen Energie und Material sowie die Art des Materials und der Anwendungen, für die sie verwendet werden. Die spektroskopischen Verfahren, die üblicherweise für die chemische Analyse verwendet werden, sind Atomspektroskopie, Spektroskopie im ultravioletten und sichtbaren Bereich (UV/VIS-Spektroskopie), Infrarotspektroskopie, Raman-Spektroskopie und Kernspinresonanzspektroskopie.

Art der Spektroskopie

Art der Strahlung

Wechselwirkungen

Wellenlänge

Gammaspektroskopie

Gammastrahlen

Atomkerne

< 0,1 nm

Röntgenfluoreszenzspektroskopie

Röntgenstrahlen

Elektronen der inneren Schale

0,01 – 2,0 nm

Vakuum-UV-Spektroskopie

Ultraviolett (UV)

Ionisierung

2,0 – 200 nm

UV/VIS-Spektroskopie

UV/VIS

Valenzelektronen

200 – 800 nm

Infrarot- und Raman-Spektroskopie

Infrarot

Schwingungen der Moleküle

0,8 – 300 mm

Mikrowellenspektroskopie 

Mikrowellen

Rotationen der Moleküle

1 mm bis 30 cm

Elektronenspinresonanzspektroskopie

Elektronenspin

Kernspinresonanzspektroskopie

Funkwellen

Kernspin

0,6 – 10 m

 

Welche molekularen Wechselwirkungen gibt es im UV-Bereich?

Übergangsarten im UV-Bereich

Welchen Einfluss haben funktionelle Gruppen auf die Spektren?

Betrachten Sie eine funktionelle Gruppe, die Atome mit einem oder mehreren freien (nichtbindenden) Elektronenpaaren enthält, die keine ultraviolette/sichtbare Strahlung absorbieren. Wenn diese funktionelle Gruppe jedoch an einen Chromophor gebunden ist, ändern sich die Intensität und Wellenlänge der Absorption. Dieses Phänomen wird als Auxochrom oder farbverstärkende Gruppe bezeichnet.

Wenn das Vorhandensein eines Auxochroms die Positionsverschiebung eines Peaks oder Signals zu einer längeren Wellenlänge verursacht, wird dies batochromer Effekt oder Rotverschiebung genannt. Die zu den batochromen Effekten beitragenden funktionellen Gruppen sind Substituenten wie Methyl-, Hydroxyl-, Halogen- und Aminogruppen.

Wenn ein Auxochrom eine Positionsverschiebung eines Peaks oder Signals zu einer kürzeren Wellenlänge verursacht, wird dies hypsochromer Effekt oder Blauverschiebung genannt. Tatsächlich verhält sich die Kombination von Chromophor und Auxochrom wie ein neues Chromophor mit einem anderen Absorptionsmaximum (λmax). Beispielweise liegt λmax von Benzol bei 256 nm, während λmax von Anilin bei 280 nm liegt. Daraus folgt, dass die NH2-Gruppe als Auxochrom wirkt und die Verschiebung von λmax zu einem grösseren Wert verursacht.

Was ist der Unterschied zwischen spektraler Bandbreite und Auflösung bei der UV/VIS-Spektroskopie?

Die spektrale Bandbreite (SBW) eines Spektrometern hängt mit der physikalischen Spaltbreite und der optischen Dispersion des Monochromatorsystems zusammen. Die Auflösung ist die Fähigkeit eines Instruments, Licht in endliche, unterschiedliche Wellenlängenbereiche aufzuteilen und jeden endlichen Bereich zu unterscheiden. Die spektrale Bandbreite wird in der Regel für scannende Instrumente verwendet, während die Auflösung in der Regel für Array-Instrumente verwendet wird.

Für die meisten Quantifizierungsanwendungen der Pharmakopöe ist eine spektrale Bandbreite von weniger als 2 nm ausreichend und das Akzeptanzkriterium für das Verhältnis beträgt 1,3. Die spektrale Auflösung kann zum Vergleich mit der spektralen Bandbreite verwendet werden.

Die Tabelle zeigt die Auflösung der UV/VIS-Spektrometer von METTLER TOLEDO, die mit Toluol in Hexan gemessen wird, und das SBW-Äquivalent.

Instrument

Spektralauflösung

SBW-Äquivalent (nm)

UV5

> 1,5

< 2,0

UV5Bio

> 1,5

< 2,0

UV5Nano

> 1,7

< 1,5

UV7

> 1,9

≤ 1,0

 

Welche verschiedenen Lichtquellen werden in einem UV/VIS-Spektrometer verwendet?

Die beste Lichtquelle würde über alle ultravioletten und sichtbaren Wellenlängen hinweg eine gute Intensität mit geringem Rauschen und über einen längeren Zeitraum Stabilität bieten. Wie unten erwähnt, gibt es eine Reihe von Lichtquellen, die üblicherweise verwendet werden.

Lichtquelle

Wellenlängenbereich

(nm)

Bereich

Lebensdauer

Wolfram-Glühlampe

350 – 2 500

VIS + IR

3 000 Std.

Deuteriumbogenlampe

190 – 400

UV

1 000 Std.

Wasserstofflampe

190 – 400

UV

1 000 Std.

Xenon-Blitzlampe

190 – 1 100

UV + VIS + NIR

5 500 Std.*

* Entspricht 50-Hz-Blitzen bei Dauerbetrieb

Welche Vorteile bietet ein Beugungsgitter gegenüber einem Prisma?

Prismen und Beugungsgitter sind typische Dispersionselemente. Ein Prisma erreicht eine Dispersion aufgrund des Unterschieds im Brechungsindex des Materials in Abhängigkeit von der Wellenlänge. Ein Beugungsgitter verwendet dagegen den Unterschied in der Beugungsrichtung für jede Wellenlänge aufgrund von Interferenz. Sowohl Prismen als auch Beugungsgitter können Lichtspektren zur Analyse in viele Farben aufteilen. Allerdings ist ein Beugungsgitter weniger empfindlich gegenüber der Farbe des Lichts und kann Farben über einen grösseren Winkel verteilen als ein Prisma. Das Glas in einem Prisma ist für sichtbares Licht klar, absorbiert und blockiert jedoch Licht im infraroten und ultravioletten Teil des Spektrums. Ein Beugungsgitter mit einigen hundert Linien pro Zoll kann das Licht in der Mitte des sichtbaren Spektrums um mindestens 20 Grad ablenken. Der Ablenkungswinkel eines Glasprismas ist im Allgemeinen viel kleiner.

Welche anorganischen Verbindungen können mit der UV/VIS-Spektroskopie gemessen werden?

Moleküle können mit der UV/VIS-Spektroskopie analysiert werden, wenn sie eine funktionelle Gruppe oder Konjugation besitzen oder einen farbigen Komplex bilden. Da anorganische Verbindungen keine funktionelle Gruppe oder Konjugation enthalten, ist das übliche Verfahren zu ihrer Analyse die Reaktion mit einer geeigneten Verbindung. Dabei entsteht ein farbiger Komplex, dessen Absorption im sichtbaren Bereich photometrisch gemessen und mit seiner Konzentration in Beziehung gesetzt werden kann. Beispielsweise wird Eisen üblicherweise analysiert, indem durch eine Reaktion mit 1,10-Phenthrolin ein roter Komplex gebildet wird. Die Absorption des Komplexes wird bei 570 nm gemessen, um die Eisenkonzentration abzuschätzen.

Wie unterscheiden sich Einstrahl- und Zweistrahl-Spektrometer?

Der Hauptunterschied zwischen einem Einstrahl- und einem Zweistrahl-Spektrometer ist folgender:

Einstrahl-Spektrometer: Ein einzelner Strahl der Lichtquelle dringt durch die Probe

Zweistrahl-Spektrometer: Der Lichtstrahl der Lichtquelle wird in zwei Teile aufgeteilt: Ein Teil dringt durch die Probe und der andere Teil dringt durch die Referenz

Die Strahlteilung in einem Zweistrahl-Spektrometer wird auf zwei Arten erreicht:

  1. Statistisch, mit teildurchlässigen Spiegeln oder einem ähnlichen Gerät
  2. Abschwächung der Lichtstrahlen durch bewegte optische und mechanische Geräte

Wie analysiert man einen festen Polymerfilm mit UV/VIS?

Wie analysiert man einen festen Polymerfilm mit UV/VIS?

Hat die Temperatur einen Einfluss auf die UV/VIS-Analyse?

Die Temperatur beeinflusst die Absorptionswerte. Unterschiedliche Lösungsmittel gehen bei unterschiedlichen Temperaturen unterschiedliche Wechselwirkungen ein. Lösungsparameter, die sich aufgrund von Temperaturänderungen ändern, sind:

  • Reaktionsgeschwindigkeit. Die Geschwindigkeit ändert sich, wenn die Temperatur erhöht wird. Dadurch kann sich die Aktivität der Probe ändern. Enzymatische/biomolekulare Reaktionen sind sehr temperaturempfindlich.
  • Löslichkeit eines gelösten Stoffes. Die Löslichkeit wird durch Temperaturschwankungen beeinflusst. Eine schlechte Löslichkeit kann zu einer ungenauen Absorption führen.
  • Ausdehnung oder Schrumpfung des Lösungsmittels. Dies kann zu einer Konzentrationsänderung der Lösung führen und die Absorption beeinflussen, da die Absorption linear mit der Konzentration zusammenhängt.
  • Schlierenmethode. Dieser Effekt kann bei Temperaturänderungen auftreten und zu einer Reihe von Konvektionsströmen führen, die die tatsächliche Absorption verändern können.

Optische Leistungsparameter wie photometrisches Rauschen, Wellenlängengenauigkeit/-wiederholbarkeit, photometrische Wiederholbarkeit und Streulicht werden durch die Temperatur im Bereich von 10 – 40 °C nicht beeinflusst.

Optische Parameter wie die photometrische Auflösung (Toluol/Hexan-Verhältnis) und die photometrischen Genauigkeitswellenlängen (K2Cr2O7 in HClO4) zeigen dagegen eine Temperaturabhängigkeit von 0,014 bis -0,034/Einheit im Bereich von 10 – 40 °C.

Die Temperaturkontrolle für die UV/VIS-Spektralphotometrie kann mit leistungsstarken Temperiersystemen wie CuveT und CuvetteChanger erreicht werden. Weitere Informationen erhalten Sie hier.

Was ist Streulicht?

Was ist Streulicht?

Warum ist der Probenraum in UV/VIS-Array-Spektrometern offen?

Der Probenraum in UV/VIS-Array-Spektrometern ist offen, da Array-Instrumente eine Umkehroptik verwenden und alle Wellenlängen des Spektrums gleichzeitig erfasst werden.

Umkehroptik: Das Licht wird gebeugt, nachdem es die Probe passiert hat. Aus diesem Grund trägt nur ein geringer Teil des externen Umgebungslichts zum Signal in einem gegebenen Wellenlängenbereich bei.

Gleichzeitige Erfassung: Mit einem Array-Detektor, der gleichzeitig 2 048 Lichtintensitätssignale liefert, wird das gesamte Spektrum innerhalb einer Sekunde aufgenommen. Da die Messung sehr schnell erfolgt, wird die Auswirkung vom Umgebungslicht deutlich gemindert.

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