Proteinkristallisation

Die Proteinkristallisation ist der Vorgang beziehungsweise die Methode zur Erzeugung strukturierter, geordneter Gitter für häufig komplexe Makromoleküle. Proteine sind im festen Zustand üblicherweise amorph und neigen zu Denaturierung, wohingegen Proteine, die in Kristallgittern vorliegen, der Denaturierung widerstehen und eine höhere Stabilität aufweisen. Proteine können in geeigneten Umgebungen mit günstigen Bedingungen kristallisieren. Die Proteinkristallisation gilt aufgrund der hochkomplexen Interaktionen von Variablen, die den Proteinkristallisationsprozess beeinflussen, als eine Mischung aus Kunst und Wissenschaft.

Der häufigste Grund für die Erzeugung von Proteinkristallen ist die Unterstützung strukturbiologischer Untersuchungen (üblicherweise per Röntgendiffraktometrie). Die Untersuchenden können in diesem Rahmen Bereiche visualisieren, die Wechselwirkungen mit anderen Molekülen ermöglichen, indem sie ein Verständnis der dreidimensionalen Strukturen von Proteinen gewinnen (z. B. zum besseren Verständnis der Wechselwirkungen von Enzymen, Substraten und Liganden). Des Weiteren ist die Kristallisation ein effektives Mittel, um reine Proteine zu erzuegen, die frei von Verunreinigungen durch andere Proteiene oder fremde biologische Materie sind. Sie ist daher eine alternative Methode zur Reinigung und Abscheidung mittels präparativer Chromatographie. 

Proteine werden als therapeutische Medikamente immer bedeutender. Die Produktion von Proteinen mit der erforderlichen Stabilität geht jedoch mit grossen Herausforderungen wie Produktvariation, Strukturverlust (wodurch die Effektivität verringert würde) und Bildung potenziell gefährlicher Nebenprodukte einher. Die Proteinkristallisation ist eine Methode zur Herstellung von reinen, stabilen sowie festen Darreichungsformen und einer Reihe von Therapeutika zur Injektion und Infusion, die mit Proteinkristallen zusammenhängen. Bisher war die Proteinkristallisation eine Laboraktivität zur Unterstützung der Röntgenkristallographie. Aufgrund des exponentiellen Wachstums von proteinbasierten Therapeutika gewinnt das Hochskalieren von Proteinkristallisationen auf Produktionsniveaus jedoch zunehmend an Bedeutung und bildet einen Schwerpunktbereich.

Das Hochskalieren der Proteinkristallisation ist grundlegend analog zur Kristallisation kleiner Moleküle in Bezug auf die Anforderungen, kritische Prozessparameter (CPP) im Labormassstab zu optimieren, um kritische Qualitätsattribute (CQA) eines Arzneimittelwirkstoffs im gewerblichen Massstab zu erreichen. Eine ganzheitliche Plattform für die Prozessentwicklung und das Hochskalieren der Proteinkristallisation umfasst üblicherweise:

• In-Situ-Charakterisierung von Partikelsystemen
• Spektroskopische Überwachung und Polymorphiecharakterisierung
• Optimierung von Verfahren und Feedbacksteuerungsstrategien durch integrierte Module und Sensoren

Im Zusammenhang mit der Proteinkristallisation gibt es wichtige pharmazeutische Anwendungen: Medizinalchemie über Strukturbiologie, Proteinwirkstoffentwicklung, Hochskalieren, Abscheidung und Reinigung, Formulierung und Wirkstoffabgabe.

• Medizinalchemie über Strukturbiologie. Fortschritte bei den Proteinkristallisationstechniken und verbesserte Röntgenkristallographie haben zur Ableitung von Zehntausenden von dreidimensionalen Proteinstrukturen geführt. Ein detailliertes Verständnis von Wechselwirkungen der Wirkstoffrezeptoren kann durch Bestimmung der Struktur dieser komplexen Makromoleküle und durch Visualisierung der Bindungsstellen erzielt werden. Diese Informationen ermöglichen auf Molekularebene ein grösseres Verständnis von Proteininhibitoren, allosterischen Aktivatoren, Co-Faktoren und sogar Enzymkatalysezentren oder „aktive Zentren“, was zu besseren Wirkstoffen mit erhöhter Wirksamkeit führt. Ein klassisches Beispiel für die Bedeutung des Verständnisses der Protein-Inhibitor-Struktur durch Kristallographie zeigt sich in den grossen Fortschritten in der Entwicklung von HIV-Proteasen.
• Entwicklung, Hochskalierung, Abscheidung und Reinigung für proteinbasierte Therapeutika. Neben der Züchtung einzelner Proteinkristalle für die Röntgenkristallographie hat die Pharmaindustrie ihre Bemühungen in der Entwicklung von proteinkristallbasierten Therapeutika verstärkt. Das Ziel dieser Applikationen besteht darin, reine und stabile Proteinkristalle zu entwickeln und auf grosse Mengen hochzuskalieren. Dabei sollen die Proteinkristalle über die richtige Partikelgrösse und eine gut kontrollierte Partikelgrössenverteilung verfügen. Im Vergleich mit der präparativen Chromatographie hat die Proteinkristallisation das Potenzial, eine kostengünstige Alternative zur Abscheidung und Reinigung von Makromolekülen und zur Isolation von chiralen Molekülen zu bieten. Die Instrumente zum Hochskalieren von Proteinkristallisationen sind analog zu denen, die zum Hochskalieren von chemischen Reaktionen verwendet werden, deren CPP und Wirkung auf CQA verstanden werden müssen.
• Formulierung und Wirkstoffabgabe. Proteintherapeutika werden als Lösungen bereitgestellt und können als Injektion oder Infusion verabreicht werden. Aufgrund der hohen benötigten Proteinabgabemengen werden die infundierten Proteinlösungen verdünnt, um Viskositäts- und Aggregationsprobleme zu vermeiden. Das ist für den Patienten und das Krankenhaus weniger praktisch, was an der für die Infusion der gesamten Behandlung benötigten Zeit liegt, aber auch das Phänomen einer geringeren Patienten-Compliance bei jeder Form einer parenteralen Verabreichung verstärken kann. Die Verwendung der kristallinen Form von Proteinen in Suspension ist von grossem Interesse, da diese Formulierungen geringere Viskositätsprobleme aufweisen und in höheren Konzentrationen abgegeben werden können. Ein weiterer wichtiger Punkt besteht darin, dass die Grösse der Proteinkristalle sorgfältig kontrolliert werden muss, damit die Suspension eine Injektions- oder Infusionsnadel einfach passieren kann. Ebenfalls von Bedeutung: Jegliche Restkristalle, die sich bei der Rekonstitution nicht auflösen, dürfen kritische Partikelgrössen ebenso nicht übersteigen. Diese könnten aufgrund einer kapillaren Akkumulation im Gefässsystem unerwünschte Nebenwirkungen verursachen, weshalb massgebliche Partikelmengen > 15 µm generell minimiert werden. 

1. Wählen Sie ein geeignetes Lösemittel. Zu den üblichen Überlegungen gehört, wie viel Stoff gelöst werden kann (Löslichkeit), wie praktisch die Handhabung des Lösungsmittels ist (Sicherheit) und wie sich das Lösungsmittel auf die Stabilität und die freien Energiezustände des Peptids oder Proteins auswirkt.
2. Erreichen Sie Übersättigung. Erwärmen Sie die lösliche Peptid-/Proteinwirkstoffsubstanz im Lösungsmittel oder Puffer auf eine maximal zulässige Toleranz (üblicherweise durch Denaturierung begrenzt). Die Lösung wird dadurch übersättigt.
3. Kristallisieren Sie das Produkt durch Kontrolle der CPP. Senken Sie die Löslichkeit durch Abkühlen, Zugabe von Antisolvens, Verdampfung oder eine Reaktion. Wenn die Löslichkeit verringert wird, wird ein Punkt erreicht, an dem Kristalle Keime bilden und dann wachsen. Hochreine Produktkristalle sollten wachsen, auch wenn Motive mit hoher freier Energie alternative oder nicht kristalline Strukturen bilden können. Wenn das verhindert werden soll, ist eine sorgfältige CCP-Kontrolle erforderlich, wenn es überhaupt praktikabel ist.
4. Erlauben Sie dem System, ein Gleichgewicht zu erreichen. Dadurch soll die Ausbeute des festen Wirkstoffprodukts maximiert werden.
5. Filtrieren und trocknen Sie das gereinigte Produkt.

Es gibt mehrere Methoden zum Züchten von Proteinkristallen. Zu den häufigsten zählen Dampfdiffusion und Feindosierung. Zur ersten Methode gibt es zwei Variationen, die als Hängetropfen- bzw. Sitztropfenmethode bezeichnet werden und im Grunde genommen gleich funktionieren. In einem abgedichteten System kommen ein Tropfen der Lösung, in dem sich das Protein befindet, Puffer und Fällmittel in ein Gleichgewicht mit einem Behälter, der höhere gelöste Konzentrationen derselben Lösung, aber ohne Protein enthält. Wasser aus dem Tropfen, der das Protein enthält, verdampft und wird zu der Lösung mit der höheren Konzentration im Behälter gezogen. Wenn die Konzentration der gelösten Stoffe im Tropfen zunimmt, beginnt das Protein zu kristallisieren. Bei dieser Feindosierungsmethode werden die Proteine und andere Reagenzien eingebracht und unter einer dünnen Mineralölschicht eingeschlossen, die eine Wasserdiffusion verhindert. Die Feindosierung basiert im Wesentlichen auf einem kleinen Reaktor, der alle notwendigen Zutaten in den richtigen, stabilen Konzentrationen enthält, um die Kristallisation zu ermöglichen.

Weil die Suche nach den richtigen Reagenzien, Parametern und Bedingungen für die Kristallisation eines Proteins häufig empirisch abläuft, besteht die praktischste Methode für eine erfolgreiche Proteinkristallisation darin, eine variierende Bandbreite an Experimentbedingungen zu nutzen, die auf vorherigen Erfahrungen beruhen. Der einfachste Weg besteht in der Nutzung gewerblich erhältlicher Proteinkristallprüfsets, die abgepackte Lösungen mit Puffern, Fällmitteln usw. in Multi-Well-Platten enthalten. Die Hängetropfen-Dampfdiffusionsmethode wird zum Züchten von Kristallen mit diesen Sets angewandt. Wenn ein Screening in grossem Massstab benötigt wird, sind Systeme mit hohem Durchsatz verfügbar, die die Feindosierungsmethode automatisieren, Zeit und eintönige Tätigkeiten ersparen und gleichzeitig die erforderliche Menge des aufgereinigten Proteins minimieren. Für Proteinkristallisationen im grossen Massstab, die für pharmazeutische und industrielle Anwendungen benötigt werden, bilden die bei Screening-Experimenten erhaltenen Informationen die Grundlage für eine Anwendung von automatisierten Reaktorsystemen in grösserem Massstab, die durch In-Situ-PAT in Echtzeit charakterisiert werden. 

Einer der wichtigsten Anfangsschritte zur Unterstützung von Prozessentwicklung und Fertigung bei einer erfolgreichen Proteinkristallisation besteht darin, sicherzustellen, dass ein angemessener Vorrat an hochreinem Protein mit guten Eigenschaften verfügbar ist. Abgesehen von seiner Reinheit (d. h. Freiheit von Kontaminationen wie z. B. Verunreinigungen durch Fermentiersubstanzen) muss das Protein homogen und stabil (oder stabilisiert) in einer Lösung mit folgenden Eigenschaften sein:

• Minimale Aggregation (Abbildung A)
• Korrekte sekundäre, tertiäre und quaternäre Struktur (Abbildung B)
• Jegliche Modifikationen von Konjugaten oder Rekombinanten (Abbildung C)

Zusätzlich müssen alle im Proteinkristallisationsprozess verwendeten Reagenzien und Lösungsmittel frei von Verunreinigungen sein, da diese eine erhebliche Auswirkung auf die Keimbildung haben können.

Ähnlich zur Kristallisation kleiner Moleküle kristallisieren Proteine aus übersättigten Lösungen. Für kleine Moleküle, die robuste Kristallgitter bilden, ist die Manipulation der Temperatur ein primäres Mittel zum Erreichen einer Übersättigung, was auch für Proteine hilfreich ist. Ein reduzierter Temperaturbereich ist jedoch zulässig, da Proteinkristalle üblicherweise Lösungsmittel in ihrer Kristallstruktur haben, häufig temperaturempfindlich sind und zu Denaturierung und Aggregation neigen.

Kleine Moleküle haben deutlich weniger stereoskopische Freiheitsgrade und kristallisieren daher leichter. In Peptiden aus grossen Molekülen treten deutlich mehr interne saure, basische, polare, nicht polare Wechselwirkungen und Abstosskräfte auf, die einer geordneten Kristallisation entgegenwirken. Das ist ein Phänomen, das sich bei noch grösseren Proteinen verschärft. Die meisten kristallisationskompatiblen Peptide enthalten ausserdem zahlreiche Disulfidbindungen, die für die Immobilisierung struktureller Motive wichtig sind. Das Mass der intramolekularen Unordnung oder möglichen Strukturvariation ist ein wichtiges Attribut für die Bestimmung, ob ein Peptid oder Protein jemals kristallisieren statt ausfallen kann. Auch wenn das Molekül mit Attributen prädisponiert ist, die für eine Kristallisation günstig sind, gibt es eine Reihe von einflussreichen Prozessparametern, die sich auf die Kommerzialisierbarkeit des Prozesses auswirken und charakterisiert werden müssen.

Abgesehen von der Temperatur gibt es noch eine Reihe von weiteren Faktoren, die die Proteinkristallisation durch Übersättigung beeinflussen/begünstigen, wie z. B. pH-Anpassung und ionische Stärke einer Lösung, Hinzufügen von Salzen und Fällmitteln wie PEG zur Reduzierung der Proteinlöslichkeit, Art des vorliegenden Liganden usw. Der Schlüssel liegt in der Übersättigung der Lösung in einer Umgebung, die den normalen Charakter des Proteins nicht beeinträchtigt. Das bedeutet auch, dass es wichtig ist, Variablen und Bedingungen zu finden, die in Kristallen mit der richtigen Morphologie, Reinheit und annehmbaren Wachstumsraten resultieren.

Proteinkristallisation erfolgt durch eine Reihe von interdependenten Mechanismen:

1. Keimbildung
2. Wachstum
3. Ausölen bei der Kristallisation
4. Agglomeration
5. Aufbrechen
6. Impfung
7. Chemische Polymorphie

Diese Mechanismen, die den Wissenschaftlern häufig verborgen bleiben, spielen eine wichtige Rolle für das Ergebnis des Kristallisationsprozesses.

Für die Entwicklung und Hochskalierung von Kristallisationen für proteinbasierte Therapeutika ist ein tiefes Verständnis der Variablen und Bedingungen erforderlich, die den Kristallisationsprozess beeinflussen. Wie bei anderen Kristallisationen wird zum Erreichen der gewünschte Kristallform, Partikelgrösse und Grössenverteilung eine sorgfältige Kontrolle benötigt, um eine konsistente Produktqualität zu erhalten. Jede Variation in den CQA von Proteinkristallsuspensionen wirkt sich direkt auf die Wirksamkeit des Therapeutikums aus. Weil Proteinkristalle hochempfindlich auf ihre Wachstumsumgebung reagieren und durch übermässige Temperatur, Lösungsmittelverlust und andere externe Belastungen oder sogar durch den Probennahmeprozess leicht beschädigt werden können, ist es wünschenswert, die CPP und die Produktqualität in situ zu messen, d. h. ohne die Kristalle aus ihrer Lösungsumgebung zu entfernen.

• Die automatisierten chemischen Reaktoren EasyMax und Optimax ermöglichen die präzise Kontrolle, Anpassung und Aufzeichnung von Parametern wie Temperatur, pH-Wert, Leitfähigkeit, Bewegungsgeschwindigkeit und Dosierung von Puffern und Hilfsstoffen, die für die erfolgreiche Entwicklung und Hochskalierung von Proteinkristallisationen von entscheidender Bedeutung sind.
• In-situ-Analyseinstrumente, die bei der Überwachung, Fehlerbehebung und Korrektur von Prozessabweichungen helfen, sind ebenfalls nützlich.
  • In-situ-Raman-Spektroskopie und FTIR-Spektroskopie verfolgen die Reagenzkonzentrationen, überwachen das Kristallstrukturwachstum und messen ausserdem die Konzentration von übersättigten Lösungen.
  • Die ParticleTrack-Technologie (mit FBRM) überwacht die sich verändernde Kristallgrösse und die Grössenverteilung in Echtzeit, während wichtige Abschnitte des Kristallisationsprozesses ablaufen.
  • EasyViewer ermöglicht eine Visualisierung und Bildanalyse des laufenden Kristallisationsprozesses.

Wenn automatische Laborreaktoren in Verbindung mit Echtzeit-In-situ-Analysegeräten verwendet werden, kann die Wirkung von Prozessparametern in Kristallisationsmechanismen wie Aggregation, Wachstum, Agglomeration, Bruch und Formänderung identifiziert werden. Präzise Kontrolle über den Kristallisationsprozess in Verbindung mit kontinuierlicher In-situ-Überwachung des Kristallbildungsfortschritts ermöglicht eine fakten- und datengestützte Optimierung und Hochskalierung.

Der automatische Laborreaktor EasyMax ist eine vollständige Arbeitsstation zur Parameteroptimierung bei der Proteinkristallisation, um die Entwicklung sowie die Konzeption und Ausführung der Hochskalierung zu unterstützen. Dieses vollautomatische System ermöglicht eine präzise Kontrolle über die Prozessparameter.

• Verwalten Sie CPP wie Dosierraten, Temperatur, Bewegung, pH-Wert und Leitfähigkeit.
• Problemlose Integration mit In-Situ-Analysen für die Kristallisation wie ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM) und EasyViewer (In-Situ-Bildanalyse).
• iC Software ermöglicht die automatisierte Ausführung und Steuerung aller Experimente und Peripheriegeräte sowie die vollständige Datenerfassung und -aufzeichnung

ReactIR nutzt die Mittel-Infrarot-Spektroskopie, um die Lösungsphase in Kristallisationsstudien zu messen. ReactIR-Messungen werden nicht durch suspendierte Feststoffe, Blasen oder andere Partikelmassen beeinflusst.

• Verfolgen Sie einzelne gelöste Kristallisationsstoffe in situ und in Echtzeit.
• Messen Sie Lösungskonzentrationen, um Übersättigungsstudien zu unterstützen.
• Bieten Sie eine umsetzbare Datenanalyse für Entscheidungsfindung und Kontrolle in Echtzeit.

ReactRaman verwendet die Raman-Spektroskopie, um eine Molekularanalyse von Partikeln in der Lösung bereitzustellen.

• Verfolgen Sie Kristallwachstum, Struktur und Morphologie zerstörungsfrei, in situ und in Echtzeit.
• Bestimmen Sie Parameterwirkungen und optimieren Sie die Kristallisationsbedingungen und Variablen zur Erreichung der Qualitätsziele.

ParticleTrack verwendet die Focused Beam Reflectance Measurement (FBRM)-Technologie und ist ein optisches, sondenbasiertes Instrument, das direkt in einem Gefäss eingeführt wird, um Veränderungen der Partikelgrösse und -anzahl in Echtzeit zu verfolgen. ParticleTrack verwendet Messungen der Verteilung der Partikelsehnenlänge (Chord Length Distribution, CLD) zur Ermittlung der Kristallgrössenverteilung (CSD).

• Proteinkristalle werden kontinuierlich überwacht während die Versuchsbedingungen variiert werden.
• Verfolgen Sie das Chargen- oder kontinuierliche Wachstum während der Kristallisation in Echtzeit, ohne das eine Probe entnommen werden muss.
• Charakterisieren Sie Bedingungen, die Keimbildung, Aggregation, Polymorphie und andere Systemattribute beeinträchtigen.

Der EasyViewer ist ein optisches, sondenbasiertes Instrument, das direkt in ein Gefäss eingeführt wird, um Bilder des Partikelsystems aufzunehmen. Der EasyViewer führt eine Bildanalyse durch und misst die Partikelzahl, Grössenverteilung und Morphologie, indem er zeitaufgelöste Inline-Bilder des Prozesses verwendet, wodurch im Laufe der Zeit eine Trendanalyse von Populationen ermöglicht wird.

• Proteinkristalle werden kontinuierlich überwacht während die Versuchsbedingungen variiert werden.
• Verfolgen Sie das Chargen- oder kontinuierliche Wachstum während der Kristallisation in Echtzeit, ohne das eine Probe entnommen werden muss.
• Visualisieren Sie Kristallisationsparameter, die Keimbildung, Aggregation, Polymorphie und andere Systemattribute in Echtzeit beeinflussen.

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Real-Time Monitoring of Biopharmaceutical Crystallization: Chord Length Distribution to Crystal Size Distribution for Lysozyme, rHu Insulin, and Vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), S. 7607 – 7619.

Die Autoren vermeldeten einen Erfolg bei der Entwicklung eines effizienten Ansatzes für die Echtzeitüberwachung von biopharmazeutischen Kristallisationen. Bei diesem Verfahren wird ParticleTrack zur Messung des CLD für eine Reihe von biopharmazeutischen Molekülen unter statischen und dynamischen Bedingungen verwendet und anschliessend werden mathematische Modelle zur Konvertierung von CLD in CSD angewendet. Die untersuchten Biomoleküle haben verschiedene Kristallformen, die von den Experimentalbedingungen der Kristallisation abhängen. Lysozym kann tetragonale, nadelförmige Kristalle produzieren, rHu Insulin bildet rhomboedrische Kristalle und B12 bildet polyedrische Kristalle.

Die Autoren haben Modell entwickelt, um den CSD für die tetragonalen, rhomboedrischen und polyedrischen Kristalle mit niedrigem Seitenverhältnis und für die Nadelkristalle mit hohem Seitenverhältnis zu bestimmen. Die Autoren haben drei verschiedene Modelle zur Bestimmung der Kristallgrössenverteilung verwendet:

• Ein von einer anderen Forschungsgruppe verwendetes Modell, bei dem angenommen wurde, das Kristalle als Kugeln (sphärischer Äquivalentdurchmesser, SED) dargestellt werden können, war für die Kristalle mit niedrigem Seitenverhältnis wirksam.
• Für Kristalle mit einem hohem Seitenverhältnis entwickelten die Autoren in dieser Studie ein breitenbasiertes Model.
• Schliesslich entwickelten sie ein Modell, das längenbasiert war und die Angabe des Seitenverhältnisses erforderte.

Die Ergebnisse aus den Modellen, die zur Berechnung des CSD aus den FBRM-Messungen entwickelt wurden, wurden anschliessend mit CSD-Messungen verglichen, die durch Bildanalysen ermittelt wurden.

Der Versuch, eine undurchsichtige, kristalline pastöse Masse zu überwachen, geht mit Herausforderungen einher; insbesondere, wenn aufgrund der Fertigungsspezifikationen eine engen Partikelgrössenverteilung (PSD) benötigt wird. Bei injizierbaren Proteinkristallformulierungen kann der PSD-Wert die Viskosität stark beeinflussen und als frühe Warnung vor Aggregation oder anderen Zersetzungsereignissen dienen, die die Formulierung potenziell beeinträchtigen können.Die In-situ-Überwachung wurde in einer Hochskalierungs-Chargen-Kristallisationsstudie zur Charakterisierung von Kristallbildung und -wachstum bei menschlichen Wachstumshormonen (hGH) verwendet. Bei einer Echtzeitanalyse wurde eine Abweichung vom üblichen PSD-Profil festgestellt, die durch Unterschiede in der Mischung zwischen den Gefässen verursacht wurde. Dies wurde durch die anschliessende Offline-Bildanalyse (IA) bestätigt.

• Orehek, J., Teslić, D., & Likozar, B. (2020). Continuous Crystallization Processes in Pharmaceutical Manufacturing: A Review. Organic Process Research & Development, 25(1), S. 16 – 42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J., & Hirasawa, I. (2020). Parameter Estimation of the Stochastic Primary Nucleation Kinetics by Stochastic Integrals Using Focused-Beam Reflectance Measurements. Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Real-Time Monitoring of Biopharmaceutical Crystallization: Chord Length Distribution to Crystal Size Distribution for Lysozyme, rHu Insulin, and Vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), S. 7607 – 7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C., & Dang, L. (2018). Manipulating crystallization in lysozyme and supramolecular self-arrangement in solution using ionic liquids. CrystEngComm, 20(16), S. 2284 – 2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D., & Orkoulas, G. (2014). Modeling and control of crystal shape in continuous protein crystallization. Chemical Engineering Science, 107, S. 47 – 57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G., & Christofides, P. D. (2014). Enhancing the Crystal Production Rate and Reducing Polydispersity in Continuous Protein Crystallization. Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), S. 15538 – 15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W., & Margolin, A. L. (2004). Protein crystals for the delivery of biopharmaceuticals. Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), S. 301 – 317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301