Grundlagen, Ausrüstung, Kalibrierung, Farbskalen und mehr
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Die Spektroskopie im ultravioletten und sichtbaren Bereich (UV/VIS-Spektroskopie) ist eine leistungsstarke Technik für verschiedenste Anwendungen in verschiedenen Branchen und Marktsegmenten.
Wenn ein Stoff bei einer bestimmten Wellenlänge ein Maximum an Licht absorbiert, besteht eine einzigartige Beziehung zwischen dem Stoff und seinem UV/VIS-Spektrum. Diese Beziehung kann für Folgendes verwendet werden:
Qualitative Analyse, d. h. Feststellung des Vorhandenseins bestimmter Stoffe. Zum Beispiel die Bestimmung des DOBI (Deterioration of Bleachability Index) und Carotin-Gehalts in Speiseölen und -fetten, die Identifizierung von Verunreinigungen durch z. B. Chrom und Eisen in Wasser, die Identifizierung von Cyanocobalamin und die Überprüfung der Reinheit von DNA/RNA.
Quantitative Analyse, d. h. Bestimmung der Mengen bestimmter Stoffe. Zum Beispiel die Konzentrationsbestimmung von Wasserinhaltsstoffen wie CSB oder Ammoniak, die Bestimmung der Bittereinheit von alkoholischen Getränken, die Messung des Zuckergehalts in Getränken und die Quantifizierung von Proteinen.
Auf dieser Seite erhalten Sie grundlegendes Wissen über die UV/VIS-Spektroskopie und ihre Anwendungen.
In den folgenden Abschnitten erhalten Sie Antworten auf Ihre Fragen zu den Grundlagen und Anwendungen der UV/VIS-Spektroskopie:
Die UV/VIS-Spektroskopie ist eine Art der Absorptionsspektroskopie, bei der eine Probe mit elektromagnetischen Strahlen verschiedener Wellenlängen in den ultravioletten (UV) und sichtbaren (VIS) Bereichen beleuchtet wird. Je nach Substanz werden die Lichtstrahlen im UV- oder sichtbaren Bereich teilweise von der Probe absorbiert. Das restliche Licht, d. h. das Durchlicht, wird von einem geeigneten Detektor als Funktion der Wellenlänge erfasst. Der Detektor erzeugt dann das einzigartige UV/VIS-Spektrum der Probe (auch Absorptionsspektrum genannt).
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Trifft Licht auf ein Objekt, kann es vom Objekt absorbiert werden; typischerweise, weil die Wellenlänge des absorbierten Lichts einer elektronischen Anregung im Objekt entspricht. Das restliche Licht wird durchgelassen, d. h. es tritt durch das Objekt. Dieser Vorgang wird Transmission genannt.
In einem Spektrometer wird die Transmission gemessen, indem das Intensitätsspektrum des von der Probe durchgelassenen Lichts (I) durch das Intensitätsspektrum des von einer Blindprobe durchgelassenen Lichts (I0) geteilt wird.
Umrechnung von Absorption/Transmission
=
Die Absorption (A), auch als optische Dichte (OD) bekannt, ist die vom Objekt absorbierte Lichtmenge und kann wie folgt ausgedrückt werden.
Transmission (T)
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Was ist das Lambert-Beer'sche Gesetz?
Das Lambert-Beer'sche Gesetz besagt, dass die von einer Lösung absorbierte Energiemenge proportional zur Pfadlänge und Konzentration ist. Einfach ausgedrückt absorbiert eine konzentriertere Lösung mehr Licht als eine verdünnte Lösung.
Die mathematische Aussage des Lambert-Beer'schen Gesetzes lautet:
A = ϵ · d · c
Wobei ϵ = molarer Absorptionskoeffizient, d = Pfadlänge und c = Konzentration. Der molare Absorptionskoeffizient ist eine einzigartige physikalische Konstante der Probe, die sich auf die Fähigkeit der Probe bezieht, Licht bei einer bestimmten Wellenlänge zu absorbieren. ϵ hat die Einheit L·mol-1·cm-1.
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Was ist der Unterschied zwischen scannenden Spektralphotometern und Array-Spektralphotometern?
Ein UV/VIS-Spektrometer ist ein Instrument zur Messung der Absorption im UV/VIS-Bereich unter Anwendung des Lambert-Beer'schen Gesetzes. Es misst die Intensität des von einer Probenlösung in einer Küvette durchgelassenen Lichts und vergleicht diese mit der Lichtintensität vor dem Durchtritt durch die Probe.
Die wichtigsten Baugruppen eines UV/VIS-Spektrometers sind die Lichtquelle, der Probenhalter, ein Dispersionsgitter zur Auftrennung des Lichts in seine verschiedenen Wellenlängen und ein geeigneter Detektor.
Scannende Spektralphotometer
Das Funktionsprinzip eines herkömmlichen scannenden Speketrometers basiert auf der fortlaufenden Messung des Transmissionswerts bei jeder definierten Wellenlänge. Das Licht wird durch ein Beugungsgitter in verschiedene Wellenlängen aufgespalten. Eine Probenküvette wird wischen Beugungsgitter und Detektor platziert.
Array-Spektralphotometer
In einem Array-Spektrometer wird die Probe von einem Kontinuum beleuchtet, d. h. von allen spektralen Komponenten auf einmal, und absorbiert somit gleichzeitig Licht verschiedener Wellenlängen. Das Durchlicht wird dann von einem Reflexionsgitter gebrochen. Mit diesem Instrument kann das UV/VIS-Spektrum schneller erfasst werden als mit einem herkömmlichen scannenden Spektrometer.
Im Vergleich zu einem scannenden Spektrometer hat ein Array-Spektrometer keine beweglichen Teile.
Laden Sie „Diodenarray- und Scanning-UV/VIS-Spektrometer im Vergleich“ herunter, um mehr zu erfahren. In diesem White Paper werden die beiden bewährten UV/VIS-Spektrometer-Konfigurationen gegenübergestellt und ihre Leistung sowie die Vorteile bewertet.
Bei kritischen UV/VIS-Messungen, vor allem bei der Qualitätskontrolle im klinischen, pharmazeutischen oder industriellen Bereich, muss ein Spektrometer unter allen Umständen spezifikationsgemäss arbeiten. Daher muss regelmässig eine Leistungsüberprüfung durchgeführt werden. Die Kalibrierresultate müssen ausserdem aufgezeichnet und gespeichert werden.
Laden Sie „Wie sollten Labore ihre UV/VIS-Spektrometer kalibrieren?“ herunter, um einen Einblick in die Bedeutung der Kalibrierung in Bezug auf die Revisionen der UV/VIS-Kapitel aus der Ph. Eur. 10 und USP42-NF37 zu erhalten.
Wichtige Parameter, die bei einem UV/VIS-Spektrometer kalibriert werden müssen
Die wichtigsten Parameter, die bei einem UV/VIS-Spektrometer kalibriert werden müssen, sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.
Leistungstest
Zertifiziertes Referenzmaterial (CRM)
Instrumentenprüfparameter
Akzeptanzkriterien
USP42-NF37
Ph. Eur. 10
Wellenlängengenauigkeit und
-wiederholbarkeit
Ho (ClO4)3: 4 % Ho2O3 in 10 % v/v HClO4
Blindwert: Luft
14 Wellenlängen
(240 nm – 650 nm)
Xe: 2 Wellenlängen (260,6, 528,6 nm)
UV (200 – 400 nm): ± 1 nm
VIS (400 – 780 nm): ± 2 nm
(S.D.) < 0,5 nm
UV (< 400 nm):
± 1 nm
VIS (> 400 nm):
± 3 nm
Photometrische
Genauigkeit und
Wiederholbarkeit**
K2Cr2O7 in 0,001 M HClO4
Blindwert: 0,001 M HClO4
60 mg/l
0 A – 2 A,
235, 257, 313, 350 nm
Bei Absorption ≤ 1 A
Genauigkeit: ± 0,010 A
Wiederholbarkeit:
S.D. ≤ 0,005 A
Bei Absorption > 1 A
Genauigkeit: ± 1 %
Wiederholbarkeit:
S.D. ≤ 0,5 %
Genauigkeit: ± 0,010 A oder ± 1 %, je nachdem, was grösser ist
Nikotinsäure in
0,1 M HCl
Blindwert: 0,1 M HCl
12 mg/l
0,26 A – 1,6 A
213, 261 nm
Photometrische Linearität
K2Cr2O7 in 0,001 M HClO4
Blindwert: 0,001 M HClO4
6 – 200 mg/l, bis zu 3,0 A,
235, 257, 313, 350 nm
Alle gemessenen Filter erfüllen die photometrischen Genauigkeitskriterien
R2> 0,999
Nikotinsäure in
0,1 M HCl
Blindwert: 0,1 M HCl
6 – 60 mg/l, bis zu 2,5 A
213, 261 nm
Streulicht entsprechend Verfahren A
(SFRM)
1,2 % w/v KCl/H2O;
10 mm Pfadlänge
Blindwert:: 1,2 % w/v KCl/H2O, 5 mm Pfadlänge
Amax bei 198 nm
≥ 0,7 A
(n. z.)
Streulicht entsprechend Verfahren B (SWM)
1,2 % w/v KCl/H2O;
10 mm Pfadlänge
Blank: H2O, 10 mm Pfadlänge
Amax bei 198 nm
≥ 2,0 A
≥ 2,0 A
Auflösung
0,02 % v/v Toluol in n-Hexan
Blindwert: n-Hexan/
n-Heptan (Ph. Eur. 10)
Amax,269/Amin,267
> 1,3
Werte sind in den jeweiligen Monografien angegeben
** Keine Angabe der photometrischen Wiederholbarkeit (Präzision) in der Ph. Eur.
S.D. – Standardabweichung
3. Die Wissenschaft der Farben
Grundlagen der Farbmessung
Farben machen unsere Welt interessanter. Wenn wir ein Objekt sehen, dringt das vom Objekt reflektierte Licht in unsere Augen ein und wird von mehreren Arten von Photorezeptoren in der Netzhaut gesammelt. Abhängig von der Empfindlichkeit des Photorezeptors können verschiedene Personen dieselbe Farbe unterschiedlich wahrnehmen.
Damit die Genauigkeit einer bestimmten Farbe allgemeingültig akzeptiert werden kann, müssen Zahlenwerte zugewiesen werden. Kurz gesagt liefern Messgeräte wie Spektrometer und Kolorimeter Farbergebnisse als Werte, sodass Farben genau und wiederholbar bestimmt werden können.
Spektrometer quantifizieren Farbdaten, indem sie die von einer Probe durchgelassenen Wellenlängen sammeln und filtern. Zur Abbildung der Farben auf einer Farbskala wird auf die Spektraldaten eine mathematische Gleichung angewendet.
Der Farbraum CIE (Commission internationale de l'éclairage) wird anhand von drei Parametern definiert: Farbton, Chroma und Helligkeit.
Der Farbton ist die dominierende Farbe eines Objekts. Die Kombination aus Primär- und Sekundärfarben ergibt den Farbton.
Chroma, oder Sättigung, beschreibt, wie kräftig oder matt eine Farbe ist.
Die Helligkeit ist die Lichtstärke der Farbe (dunkel oder hell).
Jeder CIE-Farbraum verwendet drei Koordinaten zur Ermittlung einer Farbe auf einer Skala. Die drei Primärfarbskalen sind Tristimulus CIE XYZ, CIE L*a*b*, und CIE L*u*v*.
Für das Ausdrücken einer Farbe in CIE L*a*b gilt beispielsweise Folgendes:
L* definiert die Helligkeit
a* bezeichnet den Rot-/Grünwert
b* bezeichnet den Gelb-/Blauwert
Unter Verwendung des Farbraums CIE l*a*b wären die Koordinaten für das Rot der abgebildeten Rose wie folgt:
L* = 29,00, a* = 52,48, b* = 22,23
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Farbe ist ein wichtiger Faktor für die sofortige Erkennung.
Die Bereitstellung eines erfolgreichen visuellen Erlebnisses für Verbraucher kann die Kaufentscheidung beeinflussen. Daher spielt die Farbe bei der Definition von Markenidentität und Produktkonsistenz eine entscheidende Rolle.
Verschiedene Farbskalen werden eingerichtet, um ein Produkt nach Industriestandards eindeutig zu definieren. Zu diesen Farbskalen zählen:
Skala
Standard
Anwendungen
Saybolt
ASTM D156, ASTM D6045
Um festzustellen, ob Kraftstoff (Kerosin, Benzin, Diesel, Naphtha usw.) verunreinigt ist oder sich bei der Lagerung zersetzt hat
APHA/Pt-Co/Hazen
ASTM D1209
Gelbheitsindex als Mass für Reinheitsprüfungen in der Wasser-, Chemie-, Öl- und Kunststoffindustrie
Gardner
ASTM D1544/D6166, DIN EN ISO 4630-2
Zur Prüfung von Produkten wie Harzen, Fettsäuren, Lacken und Trockenölen, die durch Erhitzen Farbe angenommen haben
CIELAB
DIN EN 11664-4, DIN 5033-3, 4630, ASTM Z 58.7.1, DIN 6174
Qualitätskontrolle für die Aroma- und Duftstoff- sowie für die Lebensmittel- und Getränkeindustrie
Zur Messung der Farbintensität und Trübung in EBC-Einheiten von Bier, Malz, Karamell usw.
USP/EUP
USP-24-Monographie 631, EP-Methode 2.2.2
Qualitätskontrolle von Arzneimitteln
Hess-Ives
DGK-Testmethode F 050.2
Zum Prüfen von Chemikalien und Tensidflüssigkeiten (hauptsächlich in der Kosmetikindustrie)
4. Mikrovolumenanalyse mit einem UV/VIS-Spektrometer
Wie führt man eine Mikrovolumenanalyse in der UV/VIS-Spektroskopie durch?
Ein Mikrovolumen-Spektrometer misst Probenvolumina bis auf 1 µl. Die Konzentration von Nukleinsäuren in einer Probe liegt normalerweise in der Grössenordnung von Nano- oder Milligramm pro Milliliter.
Es ist eine Herausforderung, solche Mikrovolumina zu verdünnen und genaue Ergebnisse zu erzielen. Daher ist eine Mikroanalyse ohne Verdünnung für die nachfolgende Analyse von Nukleinsäuren von Bedeutung.
Bei der Analyse von Nukleinsäuren wird die Mikrovolumenprobe in die Feinkammer auf der Sockeloberfläche pipettiert. Der Lichtstrahl der Lampenquelle wird durch die Lichtwellenleiter zur Mikrovolumenplattform geleitet. Da die Pfadlänge auf den Millimeterbereich reduziert ist, können höhere Analytkonzentrationen ohne Mehrfachverdünnung präzise analysiert werden.
Ein Mikrovolumensystem verwendet Glasfasertechnologie zusammen mit den inhärenten Eigenschaften der Probe (wie Oberflächenspannung), um die Probe auf der Sockelplattform zu halten und die Echtzeit-Absorption der Proben bei kleinen Volumina zu bestimmen.
Diese Vorteile machen die Mikrovolumenanalyse zur idealen Wahl für die biomolekulare Analyse.
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Qualitätskontrolle von Nukleinsäuren Die Quantifizierung von Nukleinsäuren ist eine wesentliche präanalytische Methode, um genaue und zuverlässige Ergebnisse in vielen molekularbiologischen Assays wie Next-Generation Sequencing (NGS), Polymerasekettenreaktion (PCR), Echtzeit-PCR (quantitative PCR, qPCR), Klonen und Transfektion zu erhalten.
Eine qualitative und quantitative Kontrolle von Nukleinsäuren kann durch die Bestimmung der Reinheit und der Konzentration von Nukleinsäuren durchgeführt werden.
DNA-Analysemethoden A260 gibt das Verhältnis der Konzentration von Nukleotiden und A280 das Verhältnis der restlichen Proteine an. Die Aminosäuren Tyrosin und Tryptophan absorbieren bei 280 nm und Phenylalanin absorbiert gut bei 260 nm. Dies ermöglicht die Berechnung des A260/A280-Verhältnisses für die DNA-Reinheit unter Verwendung direkter Absorptionsmessungen. DNA von guter Qualität hat ein A260/A280-Verhältnis von 1,7 bis 2,0
Proteinquantifizierungsassays Zu den verschiedenen Methoden der Quantifizierung des Gesamtproteins gehören A280, Bicinchoninsäure (BCA), Bradford, Lowry, Pierce und weitere neuartige Assays. Proteine in Lösungen haben Maxima bei 280 nm aufgrund von Aminosäuren mit aromatischen Ringen und Minima bei etwa 220 nm aufgrund von Peptidbindungen.
Die Konzentration wird nach der Warburg-Formel berechnet:
Proteinkonzentration (mg/ml) = 1,55 X (A280-Messwert) – 0,76 X (A260-Messwert)
Laden Sie den Applikationsbericht „A260/A280 Absorptionsverhältnis: Indikator für die Reinheit von DNA“ herunter, um mehr über die DNA-Analyse mittels UV/VIS-Spektroskopie zu erfahren.
Was sind die häufigsten Fehler bei der UV/VIS-Spektroskopie und bei deren Kalibrierung?
Eine gute Genauigkeit und Präzision bei UV/VIS-Messungen kann durch Vorkehrungen zur Vermeidung von Fehlern erreicht werden. Typische Fehlerrisiken, die bei der Durchführung von UV/VIS-Messungen berücksichtigt werden sollten, umfassen:
Spektraleigenschaften. Die spektrale Charakterisierung wird während des Kalibrierungsprozesses durchgeführt. Wichtige Faktoren, die zu fehlerhaften Ergebnissen führen können, sind Wellenlängengenauigkeit, spektrale Bandbreite, Streulicht und Linearität.
Photometrische Eigenschaften. Zu den photometrischen Eigenschaften zählen die spektrale Empfindlichkeit der Lichtquelle, die temperaturabhängige Empfindlichkeit von Lichtquelle und Detektor usw.
Optische Wechselwirkungen. Die Strahlungen der Lampenquelle können mit dem Küvettenmaterial wechselwirken, wodurch die Intensität der Probenabsorption verändert wird. Solche optischen Wechselwirkungen können durch die Auswahl des richtigen Küvettenmaterials vermieden werden.
Verschiedene Faktoren. Auch andere Faktoren wie Temperatur, Netzspannungsschwankungen, Schwingungen, Verunreinigungen oder Erwärmung der Probe durch das mSpektrometer beeinträchtigen die Messung.
GUVP™
Obwohl nicht alle Fehler vermieden werden können, können Fehler minimiert werden, um bessere Ergebnisse zu erzielen.
Laden Sie die Good UV/VIS Practice-Broschüre „Vertrauenswürdige Ergebnisse für die UV/VIS-Spektroskopie“ herunter.
Die Auswahl der richtigen Küvette beinhaltet die Auswahl des richtigen Materials und der richtigen Grösse basierend auf Ihrer Probe und Ihrer Ausrüstung.
Das Material der Küvette sollte bei einer gegebenen Wellenlänge eine ausreichende Transmission aufweisen. Eine Lichtdämpfung an den Küvettenwänden sollte das Ergebnis einer Analyse nicht beeinflussen. Glasküvetten werden im UV-Bereich für Analysen unter 370 nm nicht verwendet, da sie die Strahlung absorbieren. Es wird empfohlen, sie nur im sichtbaren Bereich zu verwenden.
Der folgenden Tabelle können Sie die nutzbaren Transmissionsbereiche von Küvetten entnehmen:
Material
Theoretischer Transmissionsbereich (nm)
Fern-UV-Quarzglas
170 – 2 700
Optisches Glas
320 – 2 500
Nahinfrarot-Quarzglas
220 – 3 800
UV-Silica
220 – 2 500
UV-Kunststoff
220 – 900
Einweg-PS-Zelle
340 – 750
Einweg-PMMA-Zelle
285 – 750
Die Grösse der Küvetten beeinflusst auch die Messleistung. Die nominale Strahlenpfadlänge der Küvette beträgt 10 mm. Je nach Probe kann die Länge von 1 mm bis 100 mm variiert werden.
Standardküvetten können für die meisten zu untersuchenden Proben verwendet werden. Herkömmliche Absorptions- und Fluoreszenzküvetten haben einen Aussenboden von 12,5 mm x 12,5 mm, eine Höhe von 45 mm und Innenmasse von 10 mm x 10 mm.
Küvetten mit grosser Pfadlänge (Küvetten mit einer Pfadlänge von mehr als 10 mm) werden verwendet, wenn die Probe zu verdünnt ist, während des Messvorgangs verdampft oder sich chemisch verändert.
Küvetten mit geringer Pfadlänge (Küvetten mit einer Pfadlänge von weniger als 10 mm) werden bei hohen Absorptionswerten verwendet, wenn die Verdünnung schwierig ist.
Richtige Handhabung von Küvetten
Achten Sie beim Anfassen von Küvetten darauf, sie nur an den mattierten Seiten festzuhalten. Berühren Sie die transparenten optischen Oberflächen nicht mit den Fingern, da Fingerabdrücke eine erhebliche Absorption verursachen und somit die Genauigkeit beeinflussen können.
Vermeiden Sie beim Befüllen der Küvette die Verwendung von Pasteurpipetten aus Glas, da diese die optische Oberfläche zerkratzen und dadurch weitere Störungen verursachen können. Pipetten mit Einweg-Kunststoffspitzen werden empfohlen.
Die Sauberkeit der Küvetten hat einen grossen Einfluss auf die Ergebnisse. Daher muss diese als ein sehr wichtiger Faktor berücksichtigt werden.
Zur Tiefenreinigung von Quarzküvetten werden folgende Schritte empfohlen:
Tauchen Sie die Küvetten in die Reinigungslösung.
Entfernen Sie die Reinigungslösung und spülen Sie die Küvetten mit deionisiertem Wasser.
Waschen Sie die Küvetten mit Ethanol oder Aceton, ausser bei Proteinen (siehe Tabelle unten).
Trocknen Sie die Küvetten, indem Sie sie mit einem fusselfreien Tuch abwischen und anschliessend an der Luft oder im Ofen trocknen.
Die folgende Tabelle zeigt die nutzbaren Transmissionsbereiche von Küvetten.
Wässrige Lösungen
Organische Moleküle
Schwer zu entfernende Partikel
Proteine
Schwermetalle
Fettsäuren
Reinigungslösungen
Gleiche Volumenanteile 3 M HCl und Ethanol
Waschen mit 50 % Salpetersäure
Konzentrierte HNO3 oder 2 M HCl
Gleiche Volumenanteile Ethanol und 3 M HCl
Inkubieren bei Raumtemperatur mit Trypsin
(Ethanol und Aceton werden zur Reinigung nicht empfohlen.)
Gleiche Volumenanteile Schwefelsäure 2 M und 50 % entionisiertes Wasser
Königswasser
Gleiche Volumenanteile IPA und entionisiertes Wasser
Einwirkzeit*
10 Minuten
10 Minuten
30 Sekunden
Über Nacht
20 Minuten
Abwischen
*Die in der Tabelle angegebene Einwirkzeit ist eine grobe Schätzung. Es wird jedoch empfohlen, Küvetten nur so lange zu behandeln, bis die Flecken/Verunreinigungen entfernt sind.
Glasküvetten können durch Spülen der Küvetten mit Aceton oder Ethanol und anschliessendes Spülen mit Wasser gereinigt werden. Lufttrocknung wird empfohlen.
Kunststoffküvetten können mehrmals mit entionisiertem Wasser gewaschen werden. Das Waschen von Kunststoffküvetten mit Chemikalien wird nicht empfohlen.
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Good Practice für die Verwendung von Mikrovolumen-Spektrometern
Vorbereitung der Probe Die Empfindlichkeit des Instruments kann bei verdünnten Konzentrationen biologischer Proben gering sein. Um die Empfindlichkeit bei solchen Proben zu erhöhen, kann ggf. eine höhere Konzentration der Probe notwendig sein. Für Mikrovolumenmessungen wird normalerweise ein Probenvolumen von 1 – 2 µl benötigt. Verwenden Sie zur Probennahme kalibrierte Pipetten. Es ist darauf zu achten, dass eine homogene Probe vorbereitet und zur Analyse entnommen wird.
Reinigen der Mikrovolumenplattform Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des Mikrovolumensockels und der Spiegel ordnungsgemäss gereinigt werden. Wischen Sie die Oberflächen einfach mit einem fusselfreien Tuch mit entionisiertem Wasser ab. Wenn Sie eine Pufferlösung, Reinigungsmittel oder eine klebrige Probe verwenden, reinigen Sie die Oberfläche mehrmals, bevor Sie mit der nächsten Probe fortfahren.
Platzieren der Probe auf der Plattform Bringen Sie die Probe langsam und gleichmässig auf die Oberfläche auf, um eine Blasenbildung zu vermeiden.
Arbeiten innerhalb der Nachweisgrenzen Informieren Sie sich über die niedrigste und höchste Nachweisgrenze des Geräts und arbeiten Sie innerhalb dieses Bereichs.
Allgemeine Praktiken für genaue UV/VIS-Spektroskopie
Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Probe vorbereiten und in eine Küvette oder auf eine Mikrovolumenplattform pipettieren. Die Probe sollte homogen sein.
Suspendierte Feststoffpartikel in der Probe können zu einer Streuung des Lichts führen. Filtern Sie die Probe in solchen Fällen mit einem Spritzenfilter.
Füllen Sie die Probe unter Berücksichtigung der „Z“-Abmessung des Probenhalters in eine Küvette. Dadurch wird sichergestellt, dass das Licht durch die Probe dringt. Die „Z“-Abmessung ist der Abstand vom Boden einer Küvette bis zu der Höhe, in der der Lichtstrahl durch die Probe dringt.
Reinigen Sie die Küvette vor jeder Messung mit einem fusselfreien Tuch. Verwenden Sie jedes Mal ein neues Tuch.
Verwenden Sie dasselbe Lösungsmittel/denselben Lösungspuffer, das/der bei der Probenvorbereitung verwendet wurde, als Blindprobe.
6. Anwendungen der UV/VIS-Spektroskopie in verschiedenen Branchen
Die UV/VIS-Spektroskopie wird für eine Vielzahl von Anwendungen in vielen Bereichen eingesetzt, wie z. B.:
Lebensmittel
Farbbestimmung (z. B. Wein), Gehaltsanalyse (Phosphat, SO2), Verfälschung, Bitterkeit, Farbe, Alphasäuren, Gesamtpolyphenole, freier Aminostickstoff, Anthozynogen, Jod, Eisengehalt und Thiobarbitursäurewerte (z. B. Bier)
Pharma
Die UV/VIS-Spektroskopie wird in der Pharmaindustrie häufig für qualitative Analysen (Identifikationstest), Wirkstoffanalysen (API), Auflösungsuntersuchungen, die Prüfung von Angaben auf Etiketten, die Ermittlung von Verunreinigungsprofilen/der Reinheit durch Absorption, prozentuale Zusammensetzungsanalysen, Farbanalysen und Analysen der Arzneimittelstabilität verwendet
Kosmetik
Bewertung der Photostabilität von Wirkstoffen für Rezeptierungen, Partikelcharakterisierung von UV-Blockern, Beurteilung des Farbenindex, Erkennung von Verfälschungen (Parfümindustrie), Untersuchung optischer Eigenschaften, Quantifizierung von Farbstoffen, Antioxidantien usw.
Petrochemie
Charakterisierung von Rohöl, Berechnung von Asphaltenanteilen, Rezeptierung von Indizes für Aromatengehalt, Qualität der Rohöldichte, Schwefelgehalt, Berechnung des Hildebrand-Löslichkeitsparameters (erweitert auf Bitumen, Schwer- und Schieferöle und Öle aus dem katalytischen Wirbelschichtcracken, Verkoken oder Kohleverflüssigung).
Chemie
Bestimmung chemischer Eigenschaften, abschliessende Qualitätsbewertung des Endprodukts, Untersuchung der Polymerzusammensetzung, Qualifizierung von Abwasser, Bestimmung der Reinheit und Färbeeffizienz, photokatalytischer Abbau von Polymeren/Farbstoffen, Pestizidrückstände im Boden oder Wasser
Biotechnologie
Konzentration und Reinheit von Nukleinsäure, Proteinen (A280, BCA, Biuret, Bradford Lowry, OD 600), mikrobielle Zellkulturmessungen, Denaturierung von Proteinen, kinetische Studien (enzymatische Aktivität), biologische Proben wie Blut, Plasma, Serum usw.
METTLER TOLEDO bietet eine breite Palette an validierten Anwendungsmethoden. Finden Sie die Anwendung, die Ihren Anforderungen am besten entspricht, über unsere Online-Suchmaschine.
Die verschiedenen spektroskopischen Verfahren unterscheiden sich hauptsächlich durch die verwendete Strahlung, die Wechselwirkung zwischen Energie und Material sowie die Art des Materials und der Anwendungen, für die sie verwendet werden. Die spektroskopischen Verfahren, die üblicherweise für die chemische Analyse verwendet werden, sind Atomspektroskopie, Spektroskopie im ultravioletten und sichtbaren Bereich (UV/VIS-Spektroskopie), Infrarotspektroskopie, Raman-Spektroskopie und Kernspinresonanzspektroskopie.
Art der Spektroskopie
Art der Strahlung
Wechselwirkungen
Wellenlänge
Gammaspektroskopie
Gammastrahlen
Atomkerne
< 0,1 nm
Röntgenfluoreszenzspektroskopie
Röntgenstrahlen
Elektronen der inneren Schale
0,01 – 2,0 nm
Vakuum-UV-Spektroskopie
Ultraviolett (UV)
Ionisierung
2,0 – 200 nm
UV/VIS-Spektroskopie
UV/VIS
Valenzelektronen
200 – 800 nm
Infrarot- und Raman-Spektroskopie
Infrarot
Schwingungen der Moleküle
0,8 – 300 mm
Mikrowellenspektroskopie
Mikrowellen
Rotationen der Moleküle
1 mm bis 30 cm
Elektronenspinresonanzspektroskopie
Elektronenspin
Kernspinresonanzspektroskopie
Funkwellen
Kernspin
0,6 – 10 m
Welche molekularen Wechselwirkungen gibt es im UV-Bereich?
Die Absorption von UV-Licht führt zu Elektronenübergängen von niedrigen Energieniveaus zu höheren Energieniveaus. Die Absorption ultravioletter Strahlung in organischen Molekülen ist auf bestimmte funktionelle Gruppen (Chromophore) beschränkt, die Valenzelektronen niedriger Anregungsenergie enthalten. Die molekularen Übergänge/Wechselwirkungen, die aufgrund einer UV-Absorption stattfinden können, sind:
π- π* (Pi-zu-Pi-Stern-Übergang) – von bindendem zu antibindendem Orbital
n- π* (n-zu-Pi-Stern-Übergang) – von nichtbindendem zu antibindendem Orbital
Diese Übergänge benötigen eine ungesättigte Gruppe im Molekül, welche die π-Elektronen bereitstellt.
Übergänge von σ (bindend) zu σ* (antibindend) erfordern eine höhere Energie und können daher nicht durch UV/VIS-Spektroskopie nachgewiesen werden.
Welchen Einfluss haben funktionelle Gruppen auf die Spektren?
Betrachten Sie eine funktionelle Gruppe, die Atome mit einem oder mehreren freien (nichtbindenden) Elektronenpaaren enthält, die keine ultraviolette/sichtbare Strahlung absorbieren. Wenn diese funktionelle Gruppe jedoch an einen Chromophor gebunden ist, ändern sich die Intensität und Wellenlänge der Absorption. Dieses Phänomen wird als Auxochrom oder farbverstärkende Gruppe bezeichnet.
Wenn das Vorhandensein eines Auxochroms die Positionsverschiebung eines Peaks oder Signals zu einer längeren Wellenlänge verursacht, wird dies batochromer Effekt oder Rotverschiebung genannt. Die zu den batochromen Effekten beitragenden funktionellen Gruppen sind Substituenten wie Methyl-, Hydroxyl-, Halogen- und Aminogruppen.
Wenn ein Auxochrom eine Positionsverschiebung eines Peaks oder Signals zu einer kürzeren Wellenlänge verursacht, wird dies hypsochromer Effekt oder Blauverschiebung genannt. Tatsächlich verhält sich die Kombination von Chromophor und Auxochrom wie ein neues Chromophor mit einem anderen Absorptionsmaximum (λmax). Beispielweise liegt λmax von Benzol bei 256 nm, während λmax von Anilin bei 280 nm liegt. Daraus folgt, dass die NH2-Gruppe als Auxochrom wirkt und die Verschiebung von λmax zu einem grösseren Wert verursacht.
Was ist der Unterschied zwischen spektraler Bandbreite und Auflösung bei der UV/VIS-Spektroskopie?
Die spektrale Bandbreite (SBW) eines Spektrometern hängt mit der physikalischen Spaltbreite und der optischen Dispersion des Monochromatorsystems zusammen. Die Auflösung ist die Fähigkeit eines Instruments, Licht in endliche, unterschiedliche Wellenlängenbereiche aufzuteilen und jeden endlichen Bereich zu unterscheiden. Die spektrale Bandbreite wird in der Regel für scannende Instrumente verwendet, während die Auflösung in der Regel für Array-Instrumente verwendet wird.
Für die meisten Quantifizierungsanwendungen der Pharmakopöe ist eine spektrale Bandbreite von weniger als 2 nm ausreichend und das Akzeptanzkriterium für das Verhältnis beträgt 1,3. Die spektrale Auflösung kann zum Vergleich mit der spektralen Bandbreite verwendet werden.
Die Tabelle zeigt die Auflösung der UV/VIS-Spektrometer von METTLER TOLEDO, die mit Toluol in Hexan gemessen wird, und das SBW-Äquivalent.
Instrument
Spektralauflösung
SBW-Äquivalent (nm)
UV5
> 1,5
< 2,0
UV5Bio
> 1,5
< 2,0
UV5Nano
> 1,7
< 1,5
UV7
> 1,9
≤ 1,0
Welche verschiedenen Lichtquellen werden in einem UV/VIS-Spektrometer verwendet?
Die beste Lichtquelle würde über alle ultravioletten und sichtbaren Wellenlängen hinweg eine gute Intensität mit geringem Rauschen und über einen längeren Zeitraum Stabilität bieten. Wie unten erwähnt, gibt es eine Reihe von Lichtquellen, die üblicherweise verwendet werden.
Lichtquelle
Wellenlängenbereich
(nm)
Bereich
Lebensdauer
Wolfram-Glühlampe
350 – 2 500
VIS + IR
3 000 Std.
Deuteriumbogenlampe
190 – 400
UV
1 000 Std.
Wasserstofflampe
190 – 400
UV
1 000 Std.
Xenon-Blitzlampe
190 – 1 100
UV + VIS + NIR
5 500 Std.*
* Entspricht 50-Hz-Blitzen bei Dauerbetrieb
Welche Vorteile bietet ein Beugungsgitter gegenüber einem Prisma?
Prismen und Beugungsgitter sind typische Dispersionselemente. Ein Prisma erreicht eine Dispersion aufgrund des Unterschieds im Brechungsindex des Materials in Abhängigkeit von der Wellenlänge. Ein Beugungsgitter verwendet dagegen den Unterschied in der Beugungsrichtung für jede Wellenlänge aufgrund von Interferenz. Sowohl Prismen als auch Beugungsgitter können Lichtspektren zur Analyse in viele Farben aufteilen. Allerdings ist ein Beugungsgitter weniger empfindlich gegenüber der Farbe des Lichts und kann Farben über einen grösseren Winkel verteilen als ein Prisma. Das Glas in einem Prisma ist für sichtbares Licht klar, absorbiert und blockiert jedoch Licht im infraroten und ultravioletten Teil des Spektrums. Ein Beugungsgitter mit einigen hundert Linien pro Zoll kann das Licht in der Mitte des sichtbaren Spektrums um mindestens 20 Grad ablenken. Der Ablenkungswinkel eines Glasprismas ist im Allgemeinen viel kleiner.
Welche anorganischen Verbindungen können mit der UV/VIS-Spektroskopie gemessen werden?
Moleküle können mit der UV/VIS-Spektroskopie analysiert werden, wenn sie eine funktionelle Gruppe oder Konjugation besitzen oder einen farbigen Komplex bilden. Da anorganische Verbindungen keine funktionelle Gruppe oder Konjugation enthalten, ist das übliche Verfahren zu ihrer Analyse die Reaktion mit einer geeigneten Verbindung. Dabei entsteht ein farbiger Komplex, dessen Absorption im sichtbaren Bereich photometrisch gemessen und mit seiner Konzentration in Beziehung gesetzt werden kann. Beispielsweise wird Eisen üblicherweise analysiert, indem durch eine Reaktion mit 1,10-Phenthrolin ein roter Komplex gebildet wird. Die Absorption des Komplexes wird bei 570 nm gemessen, um die Eisenkonzentration abzuschätzen.
Wie unterscheiden sich Einstrahl- und Zweistrahl-Spektrometer?
Der Hauptunterschied zwischen einem Einstrahl- und einem Zweistrahl-Spektrometer ist folgender:
Einstrahl-Spektrometer: Ein einzelner Strahl der Lichtquelle dringt durch die Probe
Zweistrahl-Spektrometer: Der Lichtstrahl der Lichtquelle wird in zwei Teile aufgeteilt: Ein Teil dringt durch die Probe und der andere Teil dringt durch die Referenz
Die Strahlteilung in einem Zweistrahl-Spektrometer wird auf zwei Arten erreicht:
Statistisch, mit teildurchlässigen Spiegeln oder einem ähnlichen Gerät
Abschwächung der Lichtstrahlen durch bewegte optische und mechanische Geräte
Wie analysiert man einen festen Polymerfilm mit UV/VIS?
Die Analyse einer festen Probe wird hauptsächlich durch Abschätzen ihrer Absorption, Transmission und Reflexion durchgeführt. Übliche Parameter, die für feste Polymere bestimmt werden, umfassen Transmission in %, Cut-Off-Wellenlänge und Gelbheitsindex. Die Probe wird auf einem Halter montiert, der speziell für feste Proben entwickelt wurde, und die Messungen werden auf die gleiche Weise wie bei flüssigen Proben durchgeführt. Ein Halter für feste Proben ermöglicht die Messung von festen Proben wie Folien oder Glas.
Hat die Temperatur einen Einfluss auf die UV/VIS-Analyse?
Die Temperatur beeinflusst die Absorptionswerte. Unterschiedliche Lösungsmittel gehen bei unterschiedlichen Temperaturen unterschiedliche Wechselwirkungen ein. Lösungsparameter, die sich aufgrund von Temperaturänderungen ändern, sind:
Reaktionsgeschwindigkeit. Die Geschwindigkeit ändert sich, wenn die Temperatur erhöht wird. Dadurch kann sich die Aktivität der Probe ändern. Enzymatische/biomolekulare Reaktionen sind sehr temperaturempfindlich.
Löslichkeit eines gelösten Stoffes. Die Löslichkeit wird durch Temperaturschwankungen beeinflusst. Eine schlechte Löslichkeit kann zu einer ungenauen Absorption führen.
Ausdehnung oder Schrumpfung des Lösungsmittels. Dies kann zu einer Konzentrationsänderung der Lösung führen und die Absorption beeinflussen, da die Absorption linear mit der Konzentration zusammenhängt.
Schlierenmethode. Dieser Effekt kann bei Temperaturänderungen auftreten und zu einer Reihe von Konvektionsströmen führen, die die tatsächliche Absorption verändern können.
Optische Leistungsparameter wie photometrisches Rauschen, Wellenlängengenauigkeit/-wiederholbarkeit, photometrische Wiederholbarkeit und Streulicht werden durch die Temperatur im Bereich von 10 – 40 °C nicht beeinflusst.
Optische Parameter wie die photometrische Auflösung (Toluol/Hexan-Verhältnis) und die photometrischen Genauigkeitswellenlängen (K2Cr2O7 in HClO4) zeigen dagegen eine Temperaturabhängigkeit von 0,014 bis -0,034/Einheit im Bereich von 10 – 40 °C.
Die Temperaturkontrolle für die UV/VIS-Spektralphotometrie kann mit leistungsstarken Temperiersystemen wie CuveT und CuvetteChanger erreicht werden. Weitere Informationen erhalten Sie hier.
Was ist Streulicht?
Streulicht ist Licht, das den Detektor erreicht und nicht von der Lichtquelle des Instruments stammt. Es folgt nicht dem optischen Weg und verursacht somit eine Abweichung bei der entsprechenden Wellenlänge. Daher ist die vom Detektor gemessene Lichtintensität höher als sie eigentlich sein sollte. Umgekehrt bedeutet dies auch, dass die gemessene Absorption niedriger ist als die tatsächliche Absorption, da sie durch das Streulicht reduziert wird. Dieser Effekt ist bei höheren Absorptionswerten (hohen Probenkonzentrationen) stärker ausgeprägt.
Laden Sie das White Paper herunter, um mehr über den Ursprung und die genaue Messung von Streulicht zu erfahren:
Warum ist der Probenraum in UV/VIS-Array-Spektrometern offen?
Der Probenraum in UV/VIS-Array-Spektrometern ist offen, da Array-Instrumente eine Umkehroptik verwenden und alle Wellenlängen des Spektrums gleichzeitig erfasst werden.
Umkehroptik: Das Licht wird gebeugt, nachdem es die Probe passiert hat. Aus diesem Grund trägt nur ein geringer Teil des externen Umgebungslichts zum Signal in einem gegebenen Wellenlängenbereich bei.
Gleichzeitige Erfassung: Mit einem Array-Detektor, der gleichzeitig 2 048 Lichtintensitätssignale liefert, wird das gesamte Spektrum innerhalb einer Sekunde aufgenommen. Da die Messung sehr schnell erfolgt, wird die Auswirkung vom Umgebungslicht deutlich gemindert.
Applikationen
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Vereint zwei Instrumente in einem, um sowohl Mikrovolumen-Analysen als auch Messungen mit Standardküvetten (1 cm) in der biowissenschaftlichen Forschung zu ermöglichen.
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