ウイルス不活化とは、バイオ医薬品の安全性を高めるために設計された手順（通常は2つのステップで構成）の第1のステップです。不活化工程では、ウイルスを添加した精製途中の医薬品懸濁液から、ウイルスを破壊、または不活化させます。通常はウイルスの周辺環境を変化させてウイルス構造の不可逆的な破壊を引き起こすことで、変性させます。
一般的に、ウイルスの変性は、 化学的、物理的、またはエネルギー的 な手段によって引き起こされます。ウイルスの除去は、目的のタンパク質または生成物からウイルスそのものを除外または分離することでウイルス安全性をさらに高める補完的なプロセスであるため、ウイルスの不活化とは異なります。
多くのバイオ医薬品製造や処理プロセスでは、ウイルスが含まれていたりウイルスで汚染される可能性があります。 病原性を持ちうるウイルスのリスクから患者に対する薬害を防ぐために、不活化や除去といった手段によってリスクを取り除く必要があります。通常は、そのいずれかのプロセスだけでは不十分です。 ウイルスに固有の特性とバイオ医薬品のタイプに応じて、ウイルス不活性化法と除去には複数の方法があります。 バイオ医薬品の多くのプロセスワークフローでは、補完的な方法を組み合わせて使用することで十分に排除できるウイルスの範囲を広げています。
不活化
ウイルスの不活化には複数の方法があります。 最も一般的なものは以下のとおりです。
これよりも使用頻度が低いウイルス不活化法として、特に血液または血清系製品向けの低温殺菌、乾熱、蒸気熱などがあります。
ウイルス除去
十分に実績があるウイルス除去法には、沈殿、クロマトグラフィー、ナノろ過などがあります。
ウイルスの不活化や除去に使用する方法の選択は、調製しているバイオ医薬品のサイズ、種類、安定性、メーカーが使用を希望する精製方法、問題となるウイルスの特性や力価によって異なります。 原薬（DS）の構造と機能はウイルス安全性と同様に重要な品質属性のため、全体を通じて評価し、維持する必要があります。 低pHや界面活性剤などによるウイルス不活化法において、複数の重要プロセスパラメータ（CPP）を高い精度で制御することは、原薬（DS）への影響と不活化を同時に行う上で重要な機能です。 有機合成リアクター を使用すると、作成したメソッド通りのパラメータで一貫性のある操作を行うことができるので、プロセス許容範囲を定めスケールアップにも耐えうる最新のプロセスを構築することができます。
低pHによるバイオ医薬品のウイルス不活化は、pH、時間、温度、タンパク質含有量、溶質/バッファ濃度の影響を受けることがわかっています。 多くのウイルスはpH 5.0〜5.5で不可逆的に変性し、効果的に破壊されます。 不活化と除去の対象となるウイルスの種類によっては、このpH範囲で十分な場合もあります。 ただし、一部のエンベロープウイルスを効果的に不活化するには3.5〜4のpH範囲が必要です。
特に多くのmAbバイオ医薬品では、複数のウイルスタイプを幅広く除去する必要があります。このため、3.5〜4を目標とする「低」pHが一般的に使用されます（図A）。 ただし、このpH範囲に長時間曝されると、一部のバイオ医薬品、特に血漿やインスリンなどのタンパク質や酵素が損傷を受けたり、不活性化されたりする可能性があります（図B）。 pHストレスに長時間曝されると、タンパク質や酵素で大規模な脱アミド化、変性、凝集が発生しやすくなります。 pH 3.5〜5.5では、ある程度まで維持されますが、免疫グロブリン溶液（IgGとIgM mAbの両方を含む）の感受性は一般に他のタンパク質や酵素よりも低くなります。 ウイルス不活化条件で十分な時間が経過した後、感染性のウイルス量は効果的に最小化されるはずです。ただし、残留ウイルス粒子、断片、その他の内容物は、まだ物理的に除去されていません（図C）。
免疫グロブリンmAb製品の場合、低pHは界面活性剤や他の溶媒とは異なり、比較的単純でフットプリントが小さく、通常はスタッフの介入や追加の手順がほぼ不要なため、ウイルス不活性化に最も頻繁に使用されています。 しかし、適切で最適な条件は、分子によって、また必要なウイルス除去の範囲によって異なります。 したがって、効果的にウイルスを不活化できるデザインスペースや操作の許容範囲を確認し検証するには、分子ごとに実験を行う必要があります。 これらのウイルス不活化における許容範囲は、通常は原薬（DS）の品質とウイルス不活化に影響を与えるすべての、もしくは少なくとも選択的な重要なプロセスパラメータ（CPP）によって決まります。 このような要因の特定と管理は製品の品質と量にプラスの影響を与えます。
伝統的に、低pHによるウイルス不活性化の実験は、設定済みの容量と濃度の免疫グロブリン溶液を、マグネティックスターラーを備えたビーカーなどの容器に入れて行います。 ほとんどの実験材料では生理的条件に近い開始pHの免疫グロブリン溶液を使用するため、ウイルス不活化実験では試薬添加パラメータを検討することになります。 通常の手動滴定は、pH測定を断続的に記録しながら、ビュレットやピペットを使用して行います。 規定の時間が経過し、目標のウイルス含有量を不活化する十分な低pH条件で他のパラメータを保持した後、再び低pH範囲から適切な生理的範囲内へ、またはわずかに塩基側の範囲へ逆滴定を行います。 この結果、低いpHを保持することによるウイルス不活化が完了します。 ここでも、さまざまな品質属性（凝集や脱アミド化など）を文書化する目的で実施するサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）などのオフライン分析用に、プロセス中のサンプリングが必要です。 高いスキルを持つ研究者は高精度の実験を行うことができますが、通常、ウイルス不活化プロセスは多くの労力を必要とし、手動プロセスの自然変動、不確かさ、再現性の課題に悩まされています。
ダウンストリームのバイオプロセスにおける低pHウイルス不活化実験は、主に試薬添加の範囲とプロセスに必要な時間を定義するために必要です。ただし、プロセスキネティクスと化合物生成プロセスパラメータの影響を評価することも重要であり、これが最終的には、堅牢で最適化されたウイルス不活化プロセスを確実に設計するための要件となります。 しかし、温度のモニタリングと制御は見落とされることが多く、このため、ウイルス不活性化用のプロセス開発実験では温度は非制御パラメータとなります。
この見落としの原因として、温度を記録するが制御しない保管用または移送用容器を使用している、もしくはパイロットシステムや商業製造規模のシステムを使用してウイルス不活化を行っていることが考えられます。また、マグネティックスターラーで制御する手動プラットフォームを使用して行う低pHウイルス不活化実験で見落とされやすいもう1つのパラメータとして、そのプロセスの代表性、特に混合物の代表性があります。混合のような単純な操作に関するデータを捕捉していないと、仮定の実験条件が適切で一貫性があったかどうかを検証できなくなります。
ウイルス不活化の単位操作のための低pH処理には、モノクローナル抗体のダウンストリームプロセスでプロセス中に生成物が凝集するといった潜在的なリスクがあります。グラクソスミスクライン社のHirenD. Ardeshna氏によるこのプレゼンテーションでは、4つのプロセスパラメータの影響を調べるための実験計画法について説明します。
溶媒または界面活性剤によるウイルス不活化法は、エンベロープウイルスで広く採用されています。 一般的に使用する試薬は、一部の低pH法によって変性や脱アミド化の問題が生じる可能性がある医薬品タンパク質や抗体の反応活性度にほとんど影響を与えません。 ウイルス不活化のための溶媒または界面活性剤による処理は、検討事項の多くは低pH法と共通しています。この方法でも、主として試薬の添加範囲（この場合は溶媒または洗浄剤）とプロセスに必要な時間を定義します。 低pHによるウイルス不活化と同様に、条件は免疫グロブリンや他の原薬（DS）のタイプによって異なります。 したがって、溶媒や界面活性剤によって効果的にウイルスを不活化できるデザインスペースや操作の許容範囲を確認し検証するには、分子ごとに実験を行う必要があります。 これらのウイルス不活化における許容範囲は、通常は原薬（DS）の品質とウイルス不活化に影響を与えるすべての、もしくは少なくとも選択的な重要なプロセスパラメータ（CPP）によって決まります。 このような要因の特定と管理は製品の品質と量にプラスの影響を与えます。
界面活性剤によるウイルス不活化の実験では、低pHの実験と同じ方法で試薬滴定を行う必要はありませんが、重要な変数のデザインスペースを評価することが必要です。 低pHの場合と同様に、溶媒または界面活性剤によるウイルス不活化実験は、慣例的に完全な手動のプロセスです。 試薬添加と制御はいずれも、複数の重要なタスクを実行する高度なスキルを持つスタッフの正確で高精度の技術に依存しています。 溶媒または界面活性剤によるウイルス不活化実験も、自然変動、不確かさ、再現性の課題の影響を受けます。
一般的に、溶媒または界面活性剤によるウイルス不活化法には、低pH法には不要な考慮事項があります。 添加した溶媒または界面活性剤を原薬（DS）または免疫グロブリン溶液から除去し、適切な分析方法で検証する必要があります。 通常、溶媒または界面活性剤は、クロマトグラフィーかタンジェンシャルフローろ過によるバッファ交換で除去します。 添加された溶媒または界面活性剤の除去は、低pHによる不活化から適切な生理的pH範囲内へ、またはわずかに塩基側の範囲へ向かって行う逆滴定の目的に多少類似しています。 カラムや溶媒/バッファ交換用の他の適切な膜を通って保管容器から物質が移動するときに、バッファ交換またはクロマトグラフ法が連続または半連続の単位操作として大規模に実行される可能性があります。 プロセス開発では、溶媒または界面活性剤によるウイルス不活化が、以降の精製または除去ステップとは個別のステップとして実施されることがあり、 このために、データまたは情報の連続性が低下する可能性があります。
トキソイド、組換えタンパク質、サブユニット、多糖類、また選ばれた少数のウイルス様粒子ワクチンなど、さまざまなワクチン製品がウイルス不活化の対象となっています。 この場合も、バイオ医薬品の特性に加えて、有効に除去する必要があるウイルスの種類を考慮して適切なウイルス不活化法を選択します。
一般的に、ウイルス粒子がバイオ医薬品となる弱毒化生ウイルスなどのワクチンタイプでは、外来性ウイルスによる汚染を防ぐ代替法や別の作業法を厳密に検討する必要があります。 そのような製品に固有の方法には、対応する原材料由来の外来性ウイルス量を有効に削減する1つまたは複数のナノろ過プロセスやクロマトグラフィープロセスが含まれることがあります。 不活化ウイルスや破壊されたウイルスを、低pHまたは溶媒や界面活性剤による適切なウイルス不活化プロセスでさらに処理することがあります。これは、ウイルス生成物を変性したり、その他の方法で破壊したりした場合でも、望ましい免疫賦活効果を維持できるためです。
一般に、オリゴヌクレオチド生成物や分子タイプでは、ウイルス不活化法は不要と見なされています。 これは主に、試薬の特性、反応条件、処理方法がウイルスにとって一貫して望ましくないからです。 現時点では、開発また製造段階にあるこのようなオリゴヌクレオチド生成物の多くは、主にタンジェンシャルフローろ過によるさまざまなバッファ交換や各種のクロマトグラフ分離によって精製、濃縮、調製されています。
in-situ FTIR/ラマン分光測定 は、アップストリーム、ダウンストリーム、コンジュゲート、調合の単位操作を通じて重要なバイオプロセスコンポーネントを追跡します。
アップストリームアプリケーションではグルコースと主要代謝物をモニタリングできますが、ダウンストリームプロセスでは、タンパク質またはワクチン濃度、安定化剤、賦形剤、不純物をすべてリアルタイムでモニタアリングし、管理できます。オフライン分析による遅延やコストは発生しません。
これにより、プロセスの終点をすばやく確認できるだけでなく、多様なプロセスパラメータが製品の品質とプロセス効率に与える影響を明確に把握することができます。
