紫外可視分光法は、紫外光(UV)と可視光(Vis)の異なる波長でサンプルによって吸収または透過される光の量を測定するために使用される科学的手法です。
このプロセスでは、サンプルにUV Vis光のビームを照射し、サンプルを通過する光の量を測定します。光の吸収と透過のパターンを分析することにより、科学者はサンプルの成分を特定して定量化できます。
物質が特定の波長で最大光を吸収するとき、物質とその紫外可視スペクトルの間には独特の関係があります。この関係は、次の目的で使用できます
紫外可視分光光度法は、化学、生物学、物理学など、多くの科学分野で、材料の特性や光との相互作用を研究するために一般的に使用されています。また、医薬品、食品、化粧品などの材料の品質管理と分析のために業界で広く使用されています。
このページでは、紫外可視分光法とその応用に関する基本的な知識を提供します。
UV Vis分光法の基礎とアプリケーションについては、次のセクションで回答を得ることができます:
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光学密度(OD)としても知られる吸光度(A)は、物体が吸収する光の量であり、次のように表すことができます。
透過率(T)
紫外可視分光法の基礎知識の詳細については、ガイド「分光光度法の応用と基礎」をダウンロードしてください。
ランベルトベールの法則は、溶液によって吸収されるエネルギーの量は経路の長さと濃度に比例すると述べています。簡単に言えば、より濃縮された溶液は、希薄な溶液よりも多くの光を吸収します。
ビールの法則の数学的ステートメントは次のとおりです
A = ϵ.d.c
ここで、ε = モル吸収率、d = 経路長、c = 濃度。 モル吸収率は、特定の波長の光を吸収するサンプルの能力に関連するサンプルの固有の物理定数です。εはL·mol-1·cm-1として単位を持っています。
紫外可視分光法の基礎の詳細については、メトラー・トレドのガイド「分光光度法のアプリケーションと基礎」をダウンロードしてください。
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従来の走査型分光光度計は、定義された各波長で連続透過率測定を行うという原理に基づいて動作します。光は回折格子によって異なる波長に分割されます。サンプルキュベットは、回折格子と検出器の間に配置されます。
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アレイ分光光度計では、サンプルは連続体、すなわち光のすべてのスペクトル成分によって一度に照らされるため、異なる波長の光を同時に吸収します。透過光は反射格子によって回折されます。この装置は、従来の走査型分光光度計を使用して取得できるよりも速くUV Visスペクトルを取得するのに役立ちます。
走査型分光光度計と比較して、アレイ分光光度計には可動部品がありません。
詳細については、「アレイとスキャン」をダウンロードしてください。このホワイトペーパーでは、確立された2つのUV Vis分光光度計のセットアップを比較し、それらの性能と利点を評価しています。
性能試験 | 認証標準物質(CRM) | 機器テストパラメータ | 受け入れ 基準 | |
USP 42 NF 37 | Ph. Eur. 10 | |||
波長精度 & 再現 | Ho(ClO4)3: 4 % Ho2O3 10 % v/v HClO4 ブランク:空気 | 14波長 (240 nm – 650 nm) Xe: 2波長 (260.6, 528.6 nm) | UV (200 – 400 nm): ± 1 nm Vis (400 – 780 nm): ± 2 nm (S.D.) < 0.5 nm | UV (< 400 nm): ± 1 nm Vis (> 400 nm): ± 3 nm |
フォト メトリック 精度 & 再現** | K2Cr2O7 in 0.001 M HClO4 空砲: 0.001 M HClO4 | 60 mg/L 0 A – 2 A, 235, 257, 313, 350 nm | 吸光度について ≤ 1A 精度 : ± 0.010A 再現： S.D. ≤ 0.005 A
吸光度について > 1A 精度： ± 1% 再現： S.D. ≤ 0.5%
| 精度： ± 0.010 A or ± 1 % のいずれか大きい方
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ニコチン酸 0.1 M HCl 空砲: 0.1 M HCl | 12 mg/L 0.26 A – 1.6 A 213, 261 nm | |||
測光線形性 | K2Cr2O7 in 0.001 M HClO4 空砲: 0.001 M HClO4
| 6 – 200 mg/L, まで 3.0 A, 235, 257, 313, 350 nm | すべての測定されたフィルターは、 測光精度の合格基準 | R2> 0.999 |
ニコチン酸 0.1 M HCl 空砲: 0.1 M HCl | 6 – 60 mg/L, まで 2.5 A 213, 261 nm | |||
手順Aに従った迷光 (SFRM) | 1.2 % w/v KCl/H2O; 10 mm パスの長さ 空砲: 1.2 % w/v KCl/H2O, 5 mm パスの長さ | Amax で 198 nm | ≥ 0.7 A | (NA) |
による迷光 プロシージャ B (SWM) | 1.2 % w/v KCl/H2O; 10 mm パスの長さ 空砲: H2O, 10 mm パスの長さ | Amax で 198 nm | ≥ 2.0 A | ≥ 2.0 A |
解決 | 0.02 % v/v トルエン n-ヘキサン中 空砲: n-ヘキサン/ n-ヘプタン (Ph. Eur. 10) | Amax,269/Amin,267 | >1.3 | レベルが記載されている それぞれで モノグラフ |
** 測光再現性(精度)の仕様はありません Ph. Eur. S.D. - 標準偏差 | ||||
CIE(国際レクレアージュ委員会)カラースケールは、色相、彩度、明度の3つのパラメータを使用して定義されます。
各 CIE カラー システムは、3 つの座標を使用してスケール上の色を見つけます。3つの原色スケールは、三刺激CIE XYZ、CIE L*a*b*、およびCIE L*u*v*です。
たとえば、色が CIE L*a*b* で表される場合:
CIE L * a * b *カラースケールを使用すると、写真のバラの赤の座標は次のようになります。
L* = 29.00, a* = 52.48, b* = 22.23
カラー測定の基本の詳細については、ガイドをダウンロードしてください。
工業規格に従って製品を一意に定義するために、さまざまなカラースケールが確立されています。これらのスケールは次のとおりです。
規模 | 標準 | アプリケーション |
セイボルト | ASTM D156, ASTM D6045 | 燃料(灯油、ガソリン、ディーゼル、ナフサなど)が汚染されているか、保管中に劣化していないかを判断する |
APHA/Pt-Co/Hazen | ASTM D1209 | 水、化学、石油、プラスチック産業における純度チェックの指標として使用される黄色度指数 |
ガードナー | ASTM D1544/D6166, DIN EN ISO 4630-2 | 樹脂、脂肪酸、ワニス、乾性油など、加熱により発色した製品の試験に |
CIELAB | DIN EN 11664-4, DIN 5033-3, 4630, ASTM Z 58.7.1 DIN 6174 | フレーバー&フレグランスおよび食品&飲料業界向けの品質管理 |
EBC | MEBAK メソッド 2.13.2、EBC メソッド 8.5、EBC メソッド 9.6 | ビール、麦芽、キャラメルなどのEBC単位で色の濃さや濁度(ヘイズ)を測定する。 |
USP/EUP | USP-24モノグラフ631、EPメソッド2.2.2 | 医薬品の品質管理 |
ヘス・アイヴス | DGK試験方法F 050.2 | 化学薬品や界面活性剤の液体の試験に使用(主に化粧品業界) |
微量分光光度計は、1 μlというマイクロボリューム級の超微量のサンプル量を測定します。サンプル中の核酸の濃度は、通常、ミリリットル当たりナノまたはマイクログラムのオーダーである。
このような微量を希釈して正確な結果を得ることは困難です。したがって、希釈なしの微量分析は、核酸の下流分析にとって重要になります。
核酸の分析中、微量サンプルは台座表面の微細区画にピペットで入れられます。ランプ光源からの光ビームは、光ファイバーによってマイクロボリュームプラットフォームに導かれます。パス長がミリメートルオーダーに短縮されるため、複数の希釈なしで高濃度の分析対象物を正確に分析できます。
マイクロボリュームシステムは、光ファイバー技術とサンプルの固有の特性(表面張力など)を使用して、サンプルを台座プラットフォーム上に保持し、少量のサンプルのリアルタイムの吸光度を決定します。
これらの利点により、微量分析は生体分子分析の理想的な選択肢となります。
オンデマンドウェビナー「核酸分析におけるUV/VIS分光分析のプラクティス」に参加して、微量分光分析に関するヒントとコツをご覧ください。
核酸の品質管理
核酸定量は、次世代シーケンシング(NGS)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リアルタイムPCR(定量PCR、qPCR)、クローニング、トランスフェクションなどの多くの分子生物学的アッセイにおいて、正確で信頼性の高い結果を得るために不可欠な分析前法です。
核酸の定性的および定量的制御は、核酸の純度および濃度を決定することによって行うことができる。
DNA解析法
A260はヌクレオチドの濃度の相関関係を示し、A280は残留タンパク質の濃度の相関関係を与える。アミノ酸のチロシンとトリプトファンは280 nmで吸収し、フェニルアラニンは260 nmでよく吸収します。これにより、直接吸光度測定を使用してDNA純度の比A260/A280を計算できます。良質のDNAのA260 / A280比は1.7〜2.0です。
タンパク質定量アッセイ
総タンパク質定量のさまざまな方法には、A280、ビシンコニン酸(BCA)、ブラッドフォード、ローリー、ピアス、およびその他の新しいアッセイが含まれます。溶液中のタンパク質は、芳香環を持つアミノ酸のために280 nmに最大値を持ち、ペプチド結合の存在のために約220 nmに最小値を持ちます。
濃度は、ウォーバーグの公式を使用して計算されます。
タンパク質濃度 (mg/ml) = 1.55 X (A280 読み取り値) – 0.76 X (A260 読み取り値)
紫外可視分光法によるDNA分析の詳細については、アプリケーション社説「260/280比:タンパク質汚染の指標」をダウンロードしてください。
紫外可視分光測定の良好な精度と精度は、エラーを回避するための予防策を講じることで達成できます。UV Vis分光測定を行う際に考慮すべき一般的なエラーリスクは次のとおりです
すべてのエラーを回避できるわけではありませんが、エラーを最小限に抑えてより良い結果を得ることができます。
'Good UV / VIS Practice のパンフレット「UV/Vis分光法の信頼できる結果」をダウンロードしてください。
次のチャートは、サンプル用セルの使用可能な伝送範囲を示しています
材料 | 理論上の伝送範囲(nm) |
遠紫外線クォーツ | 170-2700 |
光学ガラス | 320-2500 |
近赤外クォーツ | 220-3800 |
紫外線シリカ | 220-2500 |
紫外線プラスチック | 220-900 |
使い捨てPSセル | 340-750 |
使い捨てPMMAセル | 285-750 |
セルのサイズも測定能力に影響します。セルの公称放射線経路長は10mmである。サンプルに応じて、長さは1mmから100mmまで変えることができます。
Standardセルは、研究中のほとんどのサンプルに使用できます。一般的な吸収および蛍光セルは、12.5 mm x 12.5 mmの外形ベース、45 mmの高さ、および10 mm x 10 mmの内部寸法を備えています。
ロングパスセル(パス長が10mmを超えるセル)は、サンプルの希釈が強すぎる場合や、測定プロセス中にサンプルが気化したり化学変化を起こしたりする場合に使用されます。短パスセル(パス長10mm未満のセル)は、吸光度が高く希釈が困難な場合に使用されます。
サンプル用セルを正しく扱う方法は?
セルを取り扱うときは、常につや消しの側面を使用してセルを運んでください。指紋は大きな吸光度を引き起こし、精度に影響を与える可能性があるため、透明な光学面に指で触れないでください。
ガラスパスツールピペットを使用してセルを充填することは、光学面を傷つけてさらなる干渉を引き起こす可能性があるため、避けてください。使い捨てのプラスチックチップを備えたピペットをお勧めします。
セルの衛生度は結果に大きな影響を与えるため、これは非常に重要な要素として考慮する必要があります。
石英製セルのディープクリーニングには、次の手順をお勧めします
次のチャートは、サンプル用セルの使用可能な伝送範囲を示しています。
| 水溶液 | 有機分子 | 粒子の除去が難しい | タンパク質 | 重金属 | 脂肪酸s |
洗浄液 | 3 M HClとエタノールの等容量
50%硝酸で洗う | 濃縮HNO3 又は 2 M HCl | エタノールの等容量部および 3 M HCl
| トリプシンで室温でインキュベートする
(エタノールとアセトンは洗浄にはお勧めしません。 | 等容量分の硫酸2Mと50%脱イオン水
アクアレジa
| IPAと脱イオン水の等容量 |
浸漬時間* | 10分 | 10分 | 30秒 | 一夜 | 20分 | 拭く |
※表記載の浸漬時間は目安です。ただし、汚れ/汚染物質が除去されるまでセルを浸すことをお勧めします。
ガラス製セルは、アセトンまたはエタノールですすぎ、続いて水ですすぐことによって洗浄できます。風乾をお勧めします。
プラスチック製セルは、脱イオン水で数回洗浄できます。プラスチック製セルの場合は、化学薬品で洗うことはお勧めしません。
サンプルを準備する
生物学的サンプルの希釈濃度では、機器の感度が低くなる可能性があります。このようなサンプルの感度を高めるには、より高い濃度のサンプルを採取することを検討してください。微量測定には通常、1〜2μlのサンプル量が必要です。サンプルを採取するには、校正済みのピペットを使用してください。均質なサンプルを調製し、分析のために採取するように注意する必要があります。
マイクロボリュームプラットフォームを洗浄します
マイクロボリュームペデスタル表面とミラーが適切に清潔に維持されていることを確認します。脱イオン水を使用して、糸くずの出ないティッシュで表面を拭き取るだけです。緩衝液、洗剤、または粘着性のあるサンプルを使用する場合は、次のサンプルに進む前に表面を複数回洗浄してください。
プラットフォームにサンプルを配置します
ゆっくりと着実に、気泡の形成を避けるためにサンプルを表面に置きます。
検出限界内で作業する
機器の最低検出限界と最高検出限界を知り、その範囲内で作業します。
食品・飲料
紫外可視分光法は、食品および飲料製品の品質と組成を決定します。食品の色(ワインなど)、風味、香りの分析、汚染物質や不純物の存在の検出に使用できます。
医薬品
紫外可視分光法は、薬物やその他の医薬品の純度、濃度、および同一性を分析します。また、医薬品の安定性を経時的に監視するためにも使用されます。
コスメティクス・化粧品
製剤用薬剤の光安定性の評価、UV遮断剤の粒子特性評価、カラーインデックスの評価、偽和物の検出(香水産業)、光学特性の研究、染料、酸化防止剤の定量など。
石油精製
原油の特性評価、アスファルテン画分の計算、芳香族含有量の指標の定式化、原油の重力の品質、硫黄含有量、ヒルデブランド溶解係数の計算。(ビチューメン、重質&シェールオイル、流動接触分解、コークス化、石炭液化によるオイルに拡張)
化学
化学的性質の決定、最終製品の最終品質評価、ポリマー組成の研究、廃水の適格性評価、純度と染色効率の決定、ポリマー/染料の光触媒分解、土壌または水中の残留農薬
バイオテクノロジー
核酸の濃度と純度、タンパク質(A280、BCA、ビウレット、ブラッドフォードローリー、OD 600)、微生物細胞培養測定、タンパク質の変性、速度論的研究(酵素活性)、血液、血漿、血清などの生物学的サンプル。
メトラー・トレドは、検証済みの幅広いアプリケーション方法を提供しています。オンライン検索エンジンを通じて、ニーズに最適なアプリケーションを見つけてください。
異なる分光技術は、主にそれらが使用する放射線、エネルギーと材料の間の相互作用、およびそれらが使用される材料の種類と用途によって区別されます。化学分析に一般的に使用される分光技術は、原子分光法、紫外および可視分光法(UV Vis分光法)、赤外分光法、ラマン分光法、および核磁気共鳴です。
分光法の種類 | 放射線の種類 | 相互 作用 | 波長 |
Υ線分光法 | Υ線 | 原子核 | < 0.1 nm |
蛍光X線分光法 | X – 光線 | 内殻電子 | 0.01 – 2.0 nm |
真空紫外分光法 | 紫外線(UV) | イオン化 | 2.0 – 200 nm |
紫外可視分光法 | 紫外可視 | 価電子 | 200 – 800 nm |
赤外およびラマン分光法 | 赤外 | 分子振動 | 0.8 – 300 mm |
マイクロ波分光法 | 電子 レンジ | 分子回転 | 1 mm から 30 cm |
電子スピン共鳴分光法 | 電子スピン | ||
核磁気共鳴分光法 | 電波 | 核スピン | 0.6 – 10 m |
UV光の吸収は、より低いエネルギーレベルからより高いエネルギーレベルへの電子遷移をもたらす。有機分子における紫外線の吸収は、低励起エネルギーの価電子を含む特定の官能基(発色団)に制限されています。UV吸収光によって起こる分子転移/相互作用は次のとおりです。
これらの遷移は、π電子を提供するために分子内に不飽和基を必要とする。
σ(結合)からσ*(アンチボンディング)への遷移はより高いエネルギーを必要とするため、紫外可視分光法では検出できません。
紫外線/可視光線を吸収しない1つ以上の孤立電子対を持つ原子を含む官能基を考えてみましょう。しかしながら、この官能基が発色団に結合すると、吸収の強度および波長を変化させる。この現象は、補助クロムまたは色増強基と呼ばれます。
補助色素の存在は、ピークまたは信号の位置をより長い波長にシフトさせ、これはバソクロミックまたは赤方偏移と呼ばれる。バソクロミック基に寄与する官能基は、置換基、例えばメチル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、ハロゲン基およびアミノ基である。
ピークまたは信号の位置を短波長にシフトさせる補助色素は、ヒプソクロミックまたはブルーシフトと呼ばれます。実際、発色団と補助色素の組み合わせは、異なる吸収極大(λmax)を持つ新しい発色団のように振る舞います。例えば、ベンゼンは256nmでf λmaxを示し、アニリンは280nmでf λmaxを示す。したがって、NH2基は補助クロムとして作用し、λmaxのより大きな値へのシフトを引き起こします。
分光光度計のスペクトル帯域幅(SBW)は、モノクロメーターシステムの物理的なスリット幅と光学分散に関連しています。分解能とは、光を有限の異なる波長領域に分離し、各有限領域を区別する機器の能力です。スペクトル帯域幅は通常、スキャン機器に使用されますが、分解能は通常、アレイ機器に使用されます。
ほとんどの薬局方の定量目的では、2 nm未満のスペクトル帯域幅で十分であり、比率の許容基準は1.3です。スペクトル分解能は、スペクトル帯域幅との比較に使用できます。
この表は、ヘキサン中のトルエンを使用して測定されたメトラー・トレドの Excellence UV/VIS 分光光度計と同等のSBWの分解能を示しています。
楽器 | スペクトル分解能 | 等価SBW (nm) |
UV5 | > 1.5 | < 2.0 |
UV5Bio | > 1.5 | < 2.0 |
UV5Nano | > 1.7 | < 1.5 |
UV7 | > 1.9 | ≤ 1.0 |
最良の光源は、すべての紫外線および可視波長にわたって低ノイズで良好な強度を提供し、長期間にわたって安定性を提供するものです。以下に述べるように、一般的に使用される光源の範囲があります。
光源 | 波長範囲 (nm) | 地域 | 一生 |
タングステンフィラメントランプ | 350 – 2500 | VIS + IR | 3,000 hr |
重水素アークランプ | 190 – 400 | UV | 1,000 hr |
水素ランプ | 190 – 400 | UV | 1,000 hr |
キセノンフラッシュランプ | 190 – 1100 | UV + VIS + NIR | 5,500 hr* |
* 常時動作時の50Hz点滅に対応
プリズムと回折格子は典型的な分散要素です。プリズムは、波長による材料の屈折率の違いにより分散を実現します。しかし、回折格子は、干渉による波長ごとの回折方向の差を利用します。プリズムと回折格子はどちらも、分析のために光スペクトルを多くの色に広げることができます。ただし、回折格子は光の色に対する感度が低く、プリズムよりも大きな角度に色を広げることができます。プリズム内のガラスは可視光に対して透明ですが、スペクトルの赤外線および紫外線部分の光を吸収して遮断します。インチあたり数百本の回折格子は、可視スペクトルの中央にある光を少なくとも20度偏向させることができます。ガラスプリズムの偏向角は、一般にこれよりもはるかに小さい。
分子が官能基または化学修飾を有する場合、またはそれらが色の複合体を生成する場合は、UV Vis分光法を使用して分析できます。無機化合物は官能基や化学修飾を含まないため、それらを分析するための一般的な方法は、適切な化合物との反応によるものです。これにより、可視領域で吸光度を測光的に測定し、実際の濃度と相関させることができるカラーコンプレックスが生成されます。例えば、鉄は一般に1,10-フェンスロリンとの反応によって分析され、赤色の錯体を生成する。錯体の吸光度を570 nmで測定して鉄濃度を推定します。
シングルビーム分光光度計とダブルビーム分光光度計の主な違いは次のとおりです。
シングルビーム分光光度計: 光源からの単一のビームがサンプルを通過します
ダブルビーム分光光度計: 光源からの光ビームは2つの部分に分割されます:1つの部分はサンプルを通過し、他の部分は参照を通過します
ダブルビーム分光光度計でのビーム分割は、次の2つの方法で実現されます
固体サンプルの分析は、主にその吸光度、透過率、反射率を推定することによって行われます。固体ポリマーについて決定される一般的なパラメータには、透過率、カットオフ波長、黄色度指数などがあります。サンプルは固体サンプル用に特別に設計されたホルダーに取り付けられ、液体サンプルの場合と同じ方法で測定値が取得されます。固体サンプルホルダー フィルムやガラスなどの固体サンプルの測定が可能です。
温度は吸光度値に影響します。異なる溶媒は、異なる温度で異なる相互作用を受けます。温度変化によって変化する解析パラメータは次のとおりです
測光ノイズ、波長精度/再現性、測光再現性、迷光などの光学性能パラメータは、10〜40°Cの範囲内の温度の影響を受けません。
一方、測光分解能(トルエン/ヘキサン比)や測光精度波長(HClO4中のK2Cr2O7)などの光学パラメータは、10〜40°C以内で0.014〜-0.034 /ユニットの範囲の温度依存性を示します。
紫外可視分光光度法の温度制御は、CuveTやキュベットチェンジャーなどの高性能サーモスタットシステムを使用して実現できます。詳しくはこちらをご覧ください。
迷光は、機器の光源からではなく、光路をたどらない検出器に到達する光として定義され、対応する波長で偏差を引き起こします。したがって、検出器によって測定される光強度は、実際よりも高くなります。逆に、これは、迷光の寄与によって減少するため、測定された吸光度が真の吸光度よりも低いことも意味します。この効果は、吸光度値が高い(サンプル濃度が高い)ほど顕著になります。
ホワイトペーパーをダウンロードして、迷光の発生源と正確な測定の詳細をご確認ください。
UVVISアレイ分光光度計のサンプルエリアは、アレイ機器が逆光学系を使用し、スペクトルのすべての波長を同時に検出するため、開いています。
逆光学系: 光はサンプルを通過した後に回折されます。このため、外部環境光のごく一部のみが所与の波長領域の信号に寄与する。
同時検出: 2048の光強度信号を同時に提供するアレイ検出器を使用して、フルスペクトルが1秒以内に記録されます。測定が非常に高速であるため、周囲光の影響が大幅に減少します。
