紫外可見光譜：基本知識

紫外可見光譜是吸收光譜的一種，其中樣品被紫外線 (UV) 和可見光 (Vis) 範圍內各種波長的電磁射線照射。根據物質的不同，紫外線或可見光線會被樣品部分吸收。剩餘的光，即透射光，由合適的檢測器記錄為波長的函數。然後檢測器產生樣品獨特的紫外可見光譜（也稱為吸收光譜）。

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比爾-朗伯定律指出，溶液吸收的能量與路徑長度和濃度成正比。簡而言之，濃溶液比稀溶液吸收更多的光。

比爾定律的數學表述是：

A = ϵ.dc

其中 ϵ = 摩爾吸光率，d = 路徑長度，c = 濃度。
摩爾吸光率是樣品的獨特物理常數，與樣品吸收給定波長的光的能力有關。 ϵ 的單位為L·mol-1·cm-1。

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紫外可見分光光度計是一種利用比爾-朗伯定律測量紫外可見光區域吸光度的儀器。它測量穿過比色皿中樣品溶液的光強度，並將其與穿過樣品之前的光強度進行比較。

紫外可見分光光度計的主要組件是光源、樣品架、用於分離不同波長光的色散裝置、以及適當的偵測器。

與掃描分光光度計相比，陣列分光光度計沒有移動部件。

要了解更多信息，請下載“陣列與掃描”。這份白皮書比較了兩種現有的紫外可見分光光度計設定並評估了它們的性能和優勢。

分光光度測定儀器必須依照關鍵紫外可見測量的規範進行操作，特別是在臨床、製藥或工業品質控制。因此，必須定期進行性能驗證。校準結果也必須被記錄和儲存。

下載“紫外可見分光光度計實驗室應如何進行分光光度計校準”，深入了解相對於歐洲藥典中紫外可見分光光度計章節修訂的校準重要性。 10 和 USP42 NF37。

紫外可見分光光度計需要校正的主要參數如下表所示。

顏色讓我們的世界變得更有趣。當我們看到一個物體時，物體反射的光線進入我們的眼睛，並被視網膜中的幾種感光器收集。根據光感受器的敏感度，不同的人可能對相同的顏色有不同的感知。

為了普遍接受特定顏色的準確性，必須指定數值。簡而言之，分光光度計和色度計等測量設備將顏色結果作為數值提供，以確保顏色測定的準確性和可重複性。

分光光度計透過收集和過濾穿過樣品的波長來量化顏色數據。將數學方程式應用於光譜數據，將顏色映射到色標上。

CIE（國際照明委員會）色標使用三個參數定義：色調、彩度和亮度。

• 色調是物體的主色。原色和次色組合起來形成色調。
• 色度，也稱為飽和度，描述顏色的鮮豔程度或暗淡程度。
• 明度是顏色的發光強度（無論是深色或淺色）。

每個 CIE 顏色系統都使用三個座標來在刻度上定位顏色。三基色標尺是 Tristimulus CIE XYZ、CIE L*a*b* 和 CIE L*u*v*。

例如，當顏色以 CIE L*a*b* 表示時：

• L* 定義亮度
• a* 表示紅/綠值
• b* 表示黃/藍值

使用 CIE L*a*b* 色標，圖中玫瑰的紅色座標為：

L* = 29.00，a* = 52.48，b* = 22.23

要了解有關顏色測量基礎知識的更多信息，請下載指南。

顏色是即時識別的關鍵因素。

為消費者提供整體成功的視覺體驗可以影響購買決定。因此，顏色對於定義品牌識別和產品一致性非常重要。

微量分光光度計可測量低至 1 µl 的樣品體積。樣本中核酸的濃度通常為奈克或微克每毫升的量級。

稀釋如此微量的樣品並獲得準確的結果具有挑戰性。因此，無需稀釋的微量分析對於核酸的下游分析變得非常重要。

在核酸分析過程中，微量樣本被移液到基座表面的精細隔間。來自燈源的光束由光纖引導至微體積平台。由於路徑長度縮短至毫米量級，因此可以精確分析更高濃度的分析物，而無需多次稀釋。

微體積系統利用光纖技術以及樣品的固有特性（例如表面張力）將樣品保留在基座平台上，並確定小體積樣品的即時吸光度。

憑藉這些優點，微量分析成為生物分子分析的理想選擇。

參加點播網路研討會“透過核酸分析中良好的 UV/VIS 實踐最大限度地提高工作流程準確性”，了解微量分析的提示和技巧。

核酸的品質管制
核酸定量是一種重要的分析前方法，可在許多分子生物學檢測中獲得準確可靠的結果，例如次世代定序(NGS)、聚合酶鍊式反應(PCR)、即時PCR（定量PCR；qPCR） 、克隆和轉染。

可以透過測定核酸的純度和濃度來進行核酸的定性和定量控制。

DNA分析方法
A260 給出了核苷酸濃度的相關性，A280 給出了殘留蛋白質的相關性。胺基酸酪胺酸和色胺酸在 280 nm 處有吸收，苯丙胺酸在 260 nm 處吸收良好。這樣可以使用直接吸光度測量來計算 DNA 純度的 A260/A280 比率。優質 DNA 的 A260/A280 比率為 1.7–2.0

蛋白質定量分析
總蛋白定量的不同方法包括 A280、二辛可寧酸 (BCA)、Bradford、Lowry、Pierce 和其他新穎的檢測方法。由於氨基酸具有芳香環，溶液中的蛋白質在 280 nm 處具有最大值，由於肽鍵的存在，在 220 nm 左右具有最小值。

濃度使用 Warburg 公式計算：

蛋白質濃度 (mg/ml) = 1.55 X (A280 讀數) – 0.76 X (A260 讀數)

要了解有關使用紫外可見光譜進行 DNA 分析的更多信息，請下載應用社論“260/280 比率：蛋白質污染指標”。

透過採取預防措施避免錯誤，可以實現紫外可見分光光度測量的良好準確度和精確度。進行紫外可見分光光度測量時應考慮的典型錯誤風險包括：

• 光譜特徵。光譜表徵是在校準過程中進行的。可能導致錯誤結果的主要因素是波長精度、光譜頻寬、雜散光和線性度。
  
• 光度特性。光度特性包括光源的光譜靈敏度、光源和偵測器的溫度依賴性靈敏度等。
• 光學相互作用。燈源的輻射可能與比色皿材料相互作用，改變樣品吸光度的強度。選擇正確的比色皿材料可以避免這種光學交互作用。
• 各種因素。其他因素，例如溫度、線路電壓波動、振動、污染或光度計對樣品的加熱也會對測量產生不利影響。
  

儘管並非所有錯誤都可以避免，但可以最大限度地減少錯誤以獲得更好的結果。

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比色皿的大小也會影響測量能力。比色皿的標稱輻射路徑長度為 10 mm。根據樣品的不同，長度可以從 1 毫米到 100 毫米不等。

標準比色皿可用於大多數研究樣品。常見的吸收和螢光比色皿的外部底座為 12.5 毫米 x 12.5 毫米，高度為 45 毫米，內部尺寸為 10 毫米 x 10 毫米。

當樣品太稀或樣品在測量過程中蒸發或化學變化時，使用長光程比色皿（光程超過10毫米的比色皿）。

當吸光度高且稀釋困難時，使用短光程比色皿（光程小於 10 mm 的比色皿）。

如何正確處理比色皿？

處理比色皿時，請務必使用磨砂側面搬運比色皿。避免用手指觸摸透明光學表面，因為指紋會導致顯著的吸光度，進而影響準確性。

避免使用玻璃巴斯德移液管填充比色皿，因為它們可能會刮傷光學表面，從而導致進一步的干擾。建議使用帶有一次性塑膠吸頭的移液器。

比色皿的清潔度對結果有重大影響，因此我們必須將其視為一個非常重要的因素。

建議依以下步驟深度清潔石英比色皿：

• 將比色皿浸泡在清潔溶液中。
• 移除清潔溶液並用去離子水沖洗比色皿。
• 用乙醇或丙酮清洗比色皿，蛋白質除外（見下表）。
• 用不起毛的紙巾擦拭比色皿，然後風乾或烘乾。

下表給出了比色皿的可用傳輸範圍。

可以用丙酮或乙醇沖洗比色皿，然後用水沖洗來清潔玻璃比色皿。建議風乾。

塑膠比色皿可以用去離子水清洗幾次。不建議使用化學物質清洗塑膠比色皿。

準備樣品
對於稀釋濃度的生物樣品，儀器靈敏度可能較低。為了提高此類樣品的靈敏度，請考慮採用更高濃度的樣品。微體積測量通常需要 1-2 µl 的樣品體積。使用校準的移液器取樣。必須注意製備均質樣品並進行分析。

清潔微量平台
確保微量基座表面和鏡子得到正確清潔。只需用無絨紙巾和去離子水擦拭表面即可。如果使用緩衝溶液、清潔劑或黏性樣品，請在進行下一個樣品之前多次清潔表面。

將樣品放置在平台上
緩慢而穩定地將樣品放在表面上，以避免形成氣泡。

在檢測限內工作
了解儀器的最低和最高檢測限並在該範圍內工作。

• 準備樣品並將其移入比色皿或微量平台時要小心。樣品應該是均勻的。
• 如果樣品中存在任何懸浮固體顆粒，光可能會散射。在這種情況下，請使用注射器過濾器過濾樣品。
• 考慮樣品架的 z 尺寸，將樣品填滿到比色皿中。這將確保光線穿過樣品。 z 維度是從比色皿底部到光束穿過樣品的高度的距離。
• 每次測量前，請用無絨紙巾清潔比色皿。每次都使用新紙巾。
• 使用與樣品製備中所用相同的溶劑/溶液緩衝液作為空白。

紫外可見光光譜是一種多功能分析技術，在各行業中具有廣泛的應用。紫外可見分光光度計在不同產業中的一些重要應用包括：

食品與飲料

紫外可見光光譜測定食品和飲料產品的品質和成分。它可用於分析食品的顏色（例如酒）、風味和香氣，以及檢測是否有污染物或摻假物。

製藥

紫外可見光光譜分析藥物和其他醫藥產品的純度、濃度和特性。它也用於監測藥物隨時間的穩定性。

化妝品

配方製劑的光穩定性評估、紫外線阻隔劑的顆粒特性、評估顏色指數、檢測摻假（香料產業）、光學特性研究、染料、抗氧化劑的定量等。

石油化工

原油表徵、瀝青質餾分計算、芳烴含量指數制定、原油比重質量、硫含量、計算希爾德布蘭德溶解度因子。（擴展到瀝青、重油和頁岩油以及來自流化床催化裂解、焦化或煤液化）

化學

確定化學性質、成品的最終品質評估、聚合物成分研究、廢水鑑定、純度和染色效率測定、聚合物/染料的光催化降解、土壤或水中的農藥殘留

生物技術

核酸、蛋白質（A280、BCA、雙縮脲、Bradford Lowry、OD 600）的濃度和純度、微生物細胞培養測量、蛋白質變性、動力學研究（酵素活性）、生物樣本（如血液、血漿、血清等） 。

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紫外線的吸收導致電子從較低能階躍遷到較高能階。有機分子中紫外線輻射的吸收僅限於某些含有低激發能價電子的官能基（髮色團）。由於紫外線吸收而發生的分子轉變/交互作用是：

• π- π*（pi 到 pi 星形躍遷）－鍵結到反鍵軌道
• n - π*（n 到 pi 星形躍遷）－非鍵結軌道到反鍵結軌道

這些躍遷需要分子中的不飽和基團來提供 π 電子。

σ（鍵結）到 σ*（反鍵結）躍遷需要更高的能量，因此無法使用紫外可見光光譜進行檢測。

固體樣品的分析主要透過估計其吸光度、透射率和反射率來進行。固體聚合物的常見參數包括％透射率、截止波長和黃度指數。樣品安裝在專為固體樣品設計的支架上，並以與液體樣品相同的方式讀取讀數。 固體樣品支架可以測量薄膜或玻璃等固體樣品。

雜散光定義為到達偵測器的光不是來自儀器光源且不遵循光路，導致相應波長的偏差。因此，探測器測得的光強度高於實際應有的光強度。相反，這也意味著測量的吸光度低於真實吸光度，因為它會因雜散光的影響而降低。這種效應在吸光度值較高（高樣品濃度）時更為突出。

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