Správná pipetovací praxe: Lepší výsledky díky školení a podpoře

Většina aplikací v biologických vědách zahrnuje kritické kroky manipulace s kapalinami, kde pipetovaný objem přímo ovlivňuje výsledek. Pokud pipetování není konzistentní a přesné, může dojít k plýtvání časem, penězi a materiálem. Přesné pipetování tvoří základ reprodukovatelné práce, která je nezbytná pro generování smysluplných dat.

Prvním krokem ke zlepšení přesnosti pipetování je výběr správného typu pipety a správného rozsahu objemů. Pokud jde o velikost, vyberte si pipetu s nejmenším objemem, která se vejde do objemu, který pipetujete. Pokud například pipetujete 2 μl a máte 5 μl pipetu a 20 μl pipetu, dosáhnete lepší přesnosti při použití 5 μl. 

Podívejte se na tuto bílou knihu o výběru pipety, abyste pochopili, která pipeta nejlépe vyhovuje kapalině a dalším faktorům, které jsou pro vaši situaci jedinečné: Výběr správné pipety

Jakmile budete mít ten správný nástroj, uplatněte svou správnou techniku pipetování v praxi. Nastavte si plán rutinního testování, abyste maximalizovali důvěru ve své výsledky v průběhu času, a stejně jako u každého přesného přístroje se ujistěte, že zavedete pravidelný, odborný servis a režim kalibrace.

Nejjednodušším způsobem, jak rychle otestovat přesnost pipety, může být systém Rainin SmartCheck. Více se dozvíte na mt.com/SmartCheck 

Výběr správné pipety zahrnuje vyhodnocení vašich požadavků. Za prvé, jaké vzorky pipetujete? Jsou vodné? Nebo jsou viskózní, těkavé, pěnivé, korozivní nebo nebezpečné? Pro vodné a téměř vodné kapaliny jsou dobrou volbou nejběžnější pipety se vzduchovým polštářem (nazývané také pipety se vzduchovým polštářem). U viskózních, těkavých a dalších neobvyklých typů kapalin by pipeta s přímým posunutím byla lepší volbou jak z hlediska přesnosti, tak bezpečnosti. 

Jaký objem budete pipetovat? Kolik vzorků potřebujete k přenosu z jedné nádoby do druhé? Podívejte se na tuto bílou knihu o výběru pipety , abyste pochopili, která pipeta funguje nejlépe v závislosti na kapalině a dalších faktorech, které jsou pro vaši situaci jedinečné.

Pipetování nejmenších možných objemů vyžaduje specializované nástroje a techniky. Opakovací pipeta může být vaší nejlepší volbou pro opakované dávkování objemů až do 100 nL. Další pipeta může také fungovat jen pro několik dávek. Ujistěte se, že používáte pipetu nejmenší velikosti, která pojme objem, který chcete pipetovat. 

Při velmi malých objemech má pipetovací technika proporcionálně větší vliv na přesnost a reprodukovatelnost. Je důležité kontrolovat hloubku ponoření, úhel pipetování a rychlost aspirace. Plakát Pipetovací techniky od společnosti Rainin vám v tom může pomoci.

Rainin NanoRep opakovaně dávkuje alikvoty až do 100 nL. Více se dozvíte zde: mt.com/NanoRep

Nejdůležitějším faktorem přesného a reprodukovatelného vícekanálového pipetování je celistvost těsnění pro každý kanál pipety. To znamená, že každý hrot dokonale sedí na každé hřídeli s nulovým únikem vzduchu. Různí výrobci toho dosahují různými způsoby, s různou ergonomickou jednoduchostí a úrovní konzistence těsnění. Pipetovací špičky Rainin se systémem LTS LiteTouch vyžadují při vkládání a vyhazování z více kanálů minimální sílu a vždy se konzistentně zasouvají.

Kliknutím sem zobrazíte širokou nabídku vícekanálových pipet Rainin.

Při odsávání držte pipetu co nejblíže svislé poloze a vyhněte se jakémukoli úhlu většímu než 20° od osy Y. Pokud se při dávkování dotknete stěny cílové nádoby, abyste zcela vytáhli veškerou tekutinu ze špičky, je v pořádku překročit úhel 20°.

Dopředné pipetování je standardní pipetovací technikou a nejlepší volbou pro vodné vzorky. U viskózních a těkavých vzorků poskytuje reverzní pipetování lepší přesnost.

Chcete-li pipetovat dopředu, zatlačte píst dolů až na doraz a držte pipetu mimo kapalinu. Poté ponořte hrot 2-10 mm hluboko do kapaliny, se kterou pracujete – ne hlouběji. Pomalu uvolněte píst až do úplného vysunutí, aby se nasával celý objem kapaliny. Chcete-li dávkovat do cílové nádoby, přesuňte pipetu do nádoby a poté zatlačte píst rovnoměrnou rychlostí přes první doraz až k druhému dorazu – až na doraz pístu. S pístem zcela stlačeným lehce přetáhněte špičku pipety nahoru po stěně nádoby, abyste se "dotkli". To pomáhá zcela dávkovat celý objem kapaliny. Uvolněte píst, vysuňte špičku pipety, vložte novou špičku pipety a opakujte.

Chcete-li pipetovat obráceně, zatlačte píst úplně dolů přes první zarážku až na druhou zarážku – až na doraz pístu. Poté ponořte špičku do kapaliny a pomalu a rovnoměrně uvolněte píst, aby se nasával. Přesuňte se k přijímací nádobě a stiskněte píst POUZE NA PRVNÍ DORAZ, aby se dávkoval správný objem. Na špičce pipety zůstane malý zbytkový objem. Přesuňte pipetu nad nádobu na vyhazování a dávkování a zatlačte píst po zbytek cesty až k druhému dorazu, nazývanému také "vyfukovací" doraz, aby se uvolnila zbývající kapalina. 

Uvolněte píst, vysuňte špičku pipety, vložte novou špičku pipety a opakujte.

Pipetu se vzduchovým polštářem lze použít k pipetování mírně viskózních kapalin včetně krve. Chcete-li dosáhnout maximální přesnosti, použijte výše popsanou techniku reverzního pipetování. Pro viskóznější kapaliny, jako je 85% glycerol nebo Triton X-100, nabízí pipeta s přímým posunutím nejlepší přesnost a konzistenci.

Mírně těkavé kapaliny, jako je etanol, lze pipetovat pipetou se vzduchovým polštářem pomocí výše uvedené techniky reverzního pipetování. Pipety s přímým posunutím jsou však lepší volbou pro těkavé kapaliny. 

Pokud používáte pipetu se vzduchovým polštářem, před pipetováním objemu alespoň pětkrát opláchněte špičku pipety (odsávejte a dávkujte). Tím se vyrovná vzduch uvnitř pipety, čímž se zpomalí rychlost odpařování kapaliny. Rychlé odpařování těkavých kapalin rozpíná vzduch uvnitř pipety a vytlačuje kapalinu ze špičky, aniž by byl vyvíjen jakýkoli tlak na píst, což snižuje přesný výdej objemu.

S těkavými kapalinami, jako je acetonitril, se obecně lépe manipuluje s pipetou s pozitivním posunutím.

Ano, pipetování pipetami se vzduchovým polštářem může vytvářet aerosoly. Aerosoly mohou stoupat do vnitřku pipety a kontaminovat vnitřní stěny a píst. K aerosolizaci dochází snadněji, když je píst během aspirace uvolněn příliš rychle, a při příliš rychlém dávkování k němu může dojít i v opačném směru mimo pipetu. 

Chcete-li minimalizovat aerosoly, odsávejte a dávkujte pomalu a rovnoměrně. Používejte filtrované špičky. 

Pipety s přímým posunutím používají špičky ve tvaru injekční stříkačky, které zabraňují aerosolizaci. Pipeta s přímým posunutím je nejlepší volbou pro pipetování nebezpečných kapalin a kapalin se zvýšenou viskozitou nebo těkavostí.

Velmi studené nebo horké kapaliny mění tlak vzduchu v pipetách se vzduchovým polštářem, což vede k nepřesnému pipetování. 

Pipety s přímým posunutím se špičkami ve tvaru injekční stříkačky, které nemají mezi kapalinou a pístem žádnou vzduchovou kapsu, nejsou ovlivněny různými teplotami kapalin. Pipety s přímým posunutím poskytují přesné výsledky s kapalinami bez pokojové teploty.

Pokud musíte pipetovat velmi horkou nebo studenou kapalinu pomocí pipety se vzduchovým polštářem, špičku pipety předem neoplachujte – to je obvykle nejlepší postup pro dosažení nejvyšší přesnosti. Místo toho odsávejte a dávkujte rychle, abyste minimalizovali vliv teploty kapaliny na vnitřní vzduchovou mezeru pipety.

Abyste předešli vzniku bublin a pěnění při pipetování, neponořujte špičku více než 10 mm do nádržky na kapalinu a nasávejte pomalu.

Reverzní pipetování nabízí dodatečnou ochranu, protože před odsáváním zcela stisknete píst až na 2. doraz, takže nehrozí vstříknutí vzduchu do kapalného vzorku. Další informace o zpětném pipetování najdete na této stránce. 

Pipeta s přímým posunutím nevytváří při interakci s kapalinou bubliny ani pěnu, protože její špička ve tvaru injekční stříkačky nepředstavuje vzduch, se kterým by kapalina mohla interagovat.

Dekontaminujte pipetu otřením vlhkým hadříkem a čisticím prostředkem, jako je isopropanol nebo 10% roztok bělidla. Vyhněte se průhlednému plastovému okénku mikrometru.

Další možností může být autoklávování, ale zkontrolujte si specifikace přístroje pipety. Pokud je autoklávovatelný, je autoklávován celý nástroj nebo pouze kapalinový konec?  Často lze autoklávovat pouze tekutý konec.

Další informace o čištění pipety najdete na plakátu Čištění pipety .

Kalibrace je kontrolované a dokumentované měření systematické chybovosti (přesnosti) a náhodné chybovosti pipety (preciznosti). V mnoha laboratorních prostředích musí být výkonnost pipet pravidelně testována a dokumentována zákonem za specifických podmínek certifikovaných akreditovaným orgánem. 

Poskytovatelé s certifikací ISO kalibrují pipety v kontrolovaném prostředí. Výsledky jsou bezpečně zdokumentovány na kalibračním certifikátu, který doplňuje historii výkonu každého přístroje připravenou k auditu. V případě potřeby seřízení poskytují kalibrační laboratoře s certifikací ISO odborný servis s díly a mazivy doporučenými výrobcem. 

Rainin a METTLER TOLEDO jsou největší světovou organizací poskytující servis pipet s rychlou dostupností od zasílání poštou až po servis na místě. Servisní laboratoře jsou certifikovány podle normy ISO 17025 a postupy se řídí aktualizací normy ISO 8655 z roku 2022. 

Přesnost pipety – neboli pravdivost, jak se jí dnes říká – je rozdíl mezi průměrným objemem všech měření (4-10 měření) a nastaveným objemem. 

Přesnost je směrodatná odchylka všech provedených měření. Jak daleko od jednotlivých čtení jsou ostatní?

Nejistota pipety je kvantitativní termín pro její celkovou přesnost. Jedná se o kombinaci pravdivosti (míra systematické chyby) a přesnosti (míra náhodné chyby). 

Rovnice pro nejistotu je: 

Nejistota = systematická chyba + náhodná chyba * k. k (faktor pokrytí nebo Z-skóre) závisí na počtu měření. k=3,31 pro čtyři měření a 2 pro deset měření.

Pipety skladujte svisle, zavěšené na polici nebo stojanu na pipety. Udržujte pipety čisté a bez jakýchkoli nečistot. Přihrádky na pipetovací špičky udržujte zavřené.