UV Vis spektroskopija je znanstvena tehnika, ki se uporablja za merjenje količine svetlobe, ki jo vzorec absorbira ali prepusti pri različnih valovnih dolžinah ultravijolične (UV) in vidne (Vis) svetlobe.
Postopek vključuje svetilo UV Vis svetlobe skozi vzorec in meri količino svetlobe, ki prehaja skozi vzorec. Z analizo vzorca absorpcije in prenosa svetlobe lahko znanstveniki identificirajo in količinsko opredelijo sestavine vzorca.
Med snovjo in njenim spektrom UV Vis obstaja edinstveno razmerje, ko snov absorbira največ svetlobe pri določeni valovni dolžini. To razmerje lahko uporabimo za:
kvalitativno analizo, tj. ugotavljanje prisotnosti določenih snovi.
kvantitativno analizo, tj. določanje količine določenih snovi.
UV Vis spektrofotometrija se pogosto uporablja na številnih področjih znanosti, vključno s kemijo, biologijo in fiziko, za preučevanje lastnosti materialov in njihovih interakcij s svetlobo. Prav tako se pogosto uporablja v industriji za nadzor kakovosti in analizo materialov, kot so zdravila, hrana in kozmetika.
Na tej strani boste pridobili osnovno znanje o UV Vis spektroskopiji in njeni uporabi.
V naslednjih razdelkih boste dobili odgovore na vprašanja o osnovah in uporabi UV Vis-a:
UV Vis spektroskopija je vrsta absorpcijske spektroskopije, pri kateri vzorec osvetlimo z elektromagnetnimi žarki različnih valovnih dolžin v ultravijoličnem (UV) in vidnem (Vis) območju. Odvisno od snovi vzorec delno absorbira ultravijolične ali vidne svetlobne žarke. Preostalo svetlobo, tj. prepuščeno svetlobo, zabeleži ustrezen detektor v odvisnosti od valovne dolžine. Detektor nato ustvari edinstven UV Vis spekter vzorca (znan tudi kot absorpcijski spekter).
Če želite izvedeti več o osnovah spektroskopije UV Vis, prenesite vodnik METTLER TOLEDO "Spectrophotometry Applications and Fundamentals".
Ko svetloba pade na predmet, jo ta lahko absorbira, običajno zato, ker valovna dolžina absorbirane svetlobe ustreza elektronskemu vzbujanju v predmetu. Preostala svetloba se prenaša, tj. prehaja skozi predmet.
V spektrofotometru se prepustnost meri tako, da se spekter jakosti svetlobe, ki prehaja skozi vzorec (I), deli s spektrom jakosti svetlobe, ki prehaja skozi prazen vzorec (I0).
Pretvornik absorpcije/prepustnosti
=
Absorpcija (A), znana tudi kot optična gostota (OD), je količina svetlobe, ki jo predmet absorbira, in jo lahko izrazimo na naslednji način
Prepustnost (T)
Če želite izvedeti več o temeljnih znanjih o tehnikah UV Vis spektroskopije, prenesite vodnik "Uporaba in osnove spektrofotometrije".
Kaj je Beer-Lambertov zakon?
Beer-Lambertov zakon pravi, da je količina energije, ki jo absorbira raztopina, sorazmerna z dolžino poti in koncentracijo. Preprosto povedano, bolj koncentrirana raztopina absorbira več svetlobe kot razredčena raztopina.
Matematična formulacija Beerovega zakona je:
A = ϵ.d.c
Pri čemer je ϵ = molska absorptivnost, d = dolžina poti in c = koncentracija. Molarna absorptivnost je edinstvena fizikalna konstanta vzorca, ki se nanaša na sposobnost vzorca, da absorbira svetlobo pri določeni valovni dolžini. Enota ϵ je L-mol-1-cm-1.
Če želite izvedeti več o osnovah spektroskopije UV Vis, prenesite vodnik METTLER TOLEDO "Uporaba in osnove spektrofotometrije".
Kakšna je razlika med spektrofotometri s skeniranjem in spektrofotometri z matriko?
UV Vis spektrofotometer je instrument, namenjen merjenju absorbance v UV Vis območju z uporabo Beer-Lambertovega zakona. Meri jakost svetlobe, ki prehaja skozi raztopino vzorca v kiveti, in jo primerja z jakostjo svetlobe pred prehodom skozi vzorec.
Glavni sestavni deli UV Vis spektrofotometra so vir svetlobe, držalo za vzorec, disperzijska naprava za ločevanje različnih valovnih dolžin svetlobe in ustrezen detektor.
Skenirni spektrofotometer
Konvencionalni skenirni spektrofotometri delujejo po načelu zaporednih meritev transmitance pri vsaki določeni valovni dolžini. Svetloba se razdeli na različne valovne dolžine z difrakcijsko mrežo. Med difrakcijsko rešetko in detektor se namesti kiveta z vzorcem.
Spektrofotometer Array
Pri spektrofotometru z matriko vzorec osvetljuje kontinuum, tj. vse spektralne komponente svetlobe hkrati, zato hkrati absorbira svetlobo različnih valovnih dolžin. Prepuščena svetloba se nato razprši z odbojno rešetko. Ta instrument pomaga pridobiti UV Vis spekter hitreje, kot ga je mogoče pridobiti s tradicionalnim skenirnim spektrofotometrom.
V primerjavi s spektrofotometrom s skeniranjem spektrofotometer z matriko nima gibljivih delov.
Če želite izvedeti več, si prenesite "Array versus Scanning". V beli knjigi sta primerjani dve uveljavljeni postavitvi spektrofotometra UV Vis ter ocenjena njuna zmogljivost in prednosti.
Spektrofotometrični instrument mora delovati v skladu s svojimi specifikacijami za kritične meritve UV Vis, zlasti pri kliničnem, farmacevtskem ali industrijskem nadzoru kakovosti. Zato je treba redno preverjati delovanje. Rezultate umerjanja je treba tudi zabeležiti in shraniti.
Za vpogled v pomembnost kalibracije glede na revizije poglavja o spektrofotometrih UV Vis, ki jih najdete v publikaciji Ph. Eur, prenesite članek "How Should UV Vis Labs Do Spectrophotometer Calibration" (Kako naj laboratoriji UV Vis opravijo kalibracijo spektrofotometrov). 10 in USP42 NF37.
Glavni parametri, ki jih je treba kalibrirati za UV Vis spektrofotometer
Glavni parametri, ki jih je treba kalibrirati za UV Vis spektrofotometer, so prikazani v naslednji preglednici.
Preskus učinkovitosti
Certificiran referenčni material (CRM)
Instrument Testni parameter
Merila sprejemljivosti
USP 42 NF 37
Ph. Eur. 10
Natančnost valovne dolžine in
ponovljivost
Ho(ClO4)3: 4 % Ho2O3 v 10 % v/v HClO4
prazno: Zrak
14 valovnih dolžin
(240 nm - 650 nm)
Xe: 2 valovni dolžini (260,6, 528,6 nm)
UV (200-400 nm): ± 1 nm
Vis (400-780 nm): ± 2 nm
(S.D.) < 0,5 nm
UV (< 400 nm):
(± 1 nm)
Vis (> 400 nm):
(± 3 nm)
Fotometrična
natančnost in
ponovljivost**
K2Cr2O7 v 0,001 M HClO4
Slepa pogača: 0,001 M HClO4
60 mg/L
0 A - 2 A,
235, 257, 313, 350 nm
Za absorbanco ≤ 1A
Natančnost: ± 0,010A
Ponovljivost:
≤ 0,005 A
Za absorbanco > 1A
Natančnost: ± 1 %.
Ponovljivost:
S.D. ≤ 0,5 %.
Natančnost: ± 0,010 A ali ± 1 %, kar je večje
Nikotinska kislina v
0,1 M HCl
Slepa pogača: 0,1 M HCl
12 mg/L
0,26 A - 1,6 A
213, 261 nm
Fotometrična linearnost
K2Cr2O7 v 0,001 M HClO4
Slepa pogača: 0,001 M HClO4
6 - 200 mg/L, do 3,0 A,
235, 257, 313, 350 nm
Vsi izmerjeni filtri izpolnjujejo merila sprejemljivosti za fotometrično natančnost.
R2> 0,999
Nikotinska kislina v
0,1 M HCl
prazna: 0,1 M HCl
6-60 mg/L, do 2,5 A
213, 261 nm
Razpršena svetloba v skladu s postopkom A
(SFRM)
1,2 % m/v KCl/H2O;
dolžina poti 10 mm
Slepa pogača: 1,2 % m/v KCl/H2O, dolžina poti 5 mm
Amax pri 198 nm
≥ 0.7 A
(NA)
Razpršena svetloba v skladu s postopkom B (SWM)
1,2 % m/v KCl/H2O;
dolžina poti 10 mm
prazna: H2O, dolžina poti 10 mm
Amax pri 198 nm
≥ 2.0 A
≥ 2.0 A
Ločljivost
0,02 % v/v toluena v n-heksanu
Slepa pogača: n-heksan/
n-heptan (Ph. Eur. 10)
Amax,269/Amin,267
>1.3
Ravni so navedene v ustrezni monografiji
** Fotometrična ponovljivost (natančnost) ni navedena v Ph. Eur.
S.D. - standardni odklon
3. Znanost o barvah
Osnove merjenja barv
Barve naredijo naš svet zanimivejši. Ko vidimo predmet, svetloba, ki se odbije od predmeta, vstopi v naše oči in jo zbere več vrst fotoreceptorjev v mrežnici. Glede na občutljivost fotoreceptorjev lahko različni ljudje različno zaznavajo isto barvo.
Da bi lahko univerzalno sprejeli natančnost določene barve, je treba dodeliti številčne vrednosti. Skratka, merilna oprema, kot so spektrofotometri in kolorimetri, podaja barvne rezultate kot vrednosti, da se zagotovita natančnost in ponovljivost določanja barv.
Spektrofotometri kvantificirajo barvne podatke z zbiranjem in filtriranjem valovnih dolžin, ki se prenašajo skozi vzorec. Na spektralne podatke se uporabi matematična enačba, ki prikaže barvo na barvni lestvici.
Barvna lestvica CIE (Commission internationale de l'éclairage) je opredeljena s tremi parametri: odtenek, barva in svetlost.
Odtenek je prevladujoča barva predmeta. Osnovne in sekundarne barve skupaj tvorijo odtenek.
Kroma, znana tudi kot nasičenost, opisuje, kako živa ali motna je barva.
Svetlost je svetlobna intenzivnost barve (ali je temna ali svetla).
Vsak barvni sistem CIE uporablja tri koordinate za določitev barve na lestvici. Tri osnovne barvne lestvice so Tristimulus CIE XYZ, CIE L*a*b* in CIE L*u*v*.
Ko je barva izražena v CIE L*a*b*, je na primer
L* opredeljuje svetlost
a* označuje rdečo/zeleno vrednost
b* označuje vrednost rumene/modre barve
Koordinate za rdečo barvo vrtnice na sliki bi bile po barvni lestvici CIE L*a*b* naslednje:
L* = 29,00, a* = 52,48, b* = 22,23
Če želite izvedeti več o osnovah merjenja barv, prenesite vodnik.
Barva je ključni dejavnik za takojšnjo prepoznavnost.
Zagotavljanje splošne uspešne vizualne izkušnje za potrošnike lahko vpliva na odločitev o nakupu. Zato je barva pomembna pri opredelitvi identitete blagovne znamke in doslednosti izdelka.
Za edinstveno opredelitev izdelka v skladu z industrijskimi standardi so vzpostavljene različne barvne lestvice. Te lestvice vključujejo:
Lestvica
Standard
Uporaba
Saybolt
ASTM D156, ASTM D6045
Za ugotavljanje, ali je gorivo (kerozin, bencin, dizelsko gorivo, nafta itd.) onesnaženo ali se je med skladiščenjem razgradilo
APHA/Pt-Co/Hazen
ASTM D1209
Indeks rumenosti, ki se uporablja kot metrika za preverjanje čistosti v vodni, kemični, naftni in plastični industriji
Gardner
ASTM D1544/D6166, DIN EN ISO 4630-2
Za preskušanje izdelkov, kot so smole, maščobne kisline, laki in sušilna olja, ki so s segrevanjem pridobili barvo
CIELAB
DIN EN 11664-4, DIN 5033-3, 4630, ASTM Z 58.7.1 DIN 6174
Nadzor kakovosti za industrijo okusov in dišav ter industrijo hrane in pijač
Metoda MEBAK 2.13.2, metoda EBC 8.5, metoda EBC 9.6
Za merjenje intenzivnosti barve in motnosti (motnosti) v enotah EBC piva, slada, karamele itd.
USP/EUP
USP-24 Monografija 631, EP metoda 2.2.2
Nadzor kakovosti zdravil
Hess-Ives
DGK testna metoda F 050.2
Uporablja se za preskušanje kemikalij in površinsko aktivnih tekočin (predvsem v kozmetični industriji)
4. Analiza mikroobsežnosti z UV Vis spektrofotometrom
Kako opraviti analizo mikroobsežnosti v UV Vis spektroskopiji?
Spektrofotometer z mikroobsegom meri volumne vzorcev že od 1 µl. Koncentracija nukleinskih kislin v vzorcu je navadno reda nano- ali mikrogramov na mililiter.
Razredčevanje takšnih mikroobmočij in pridobivanje natančnih rezultatov je zahtevno. Zato postaja mikroanaliza brez redčenja pomembna za nadaljnje analize nukleinskih kislin.
Med analizo nukleinskih kislin se mikroobsežni vzorec odpipetira v fini predel na površini podstavka. Svetlobni žarek iz vira svetlobe se z optičnimi vlakni usmeri na ploščad z mikroobjemom. Ker se dolžina poti zmanjša na milimeter, je mogoče natančno analizirati večjo koncentracijo analita brez večkratnega redčenja.
Sistem za mikroobsege uporablja tehnologijo optičnih vlaken skupaj z lastnostmi vzorca (kot je površinska napetost) za zadrževanje vzorca na podstavku in določanje absorpcije vzorcev v realnem času pri majhnih volumnih.
S temi prednostmi postane mikroobjemna analiza idealna izbira za biomolekularno analizo.
Udeležite se spletnega seminarja na zahtevo "Povečajte natančnost delovnega postopka z dobro prakso UV/VIS pri analizah nukleinskih kislin", kjer boste našli nasvete in trike o analizi mikroveličin.
Nadzor kakovosti nukleinskih kislin Kvantifikacija nukleinskih kislin je bistvena predanalitična metoda za pridobitev natančnih in zanesljivih rezultatov pri številnih molekularnobioloških testih, kot so sekvenciranje naslednje generacije (NGS), verižna reakcija s polimerazo (PCR), PCR v realnem času (kvantitativna PCR; qPCR), kloniranje in transfekcija.
Kvalitativni in kvantitativni nadzor nukleinskih kislin se lahko izvaja z določanjem čistosti in koncentracije nukleinskih kislin.
Metode za analizo DNK A260 določa korelacijo koncentracije nukleotidov, A280 pa koncentracijo preostalih proteinov. Aminokislini tirozin in triptofan absorbirata pri 280 nm, fenilalanin pa dobro absorbira pri 260 nm. To omogoča izračun razmerja A260/A280 za čistost DNA z neposrednimi meritvami absorpcije. Razmerje A260/A280 kakovostne DNK je 1,7-2,0
Preskusi za kvantifikacijo beljakovin Različne metode kvantifikacije skupnih beljakovin vključujejo A280, bikinchoninsko kislino (BCA), Bradfordove, Lowryjeve, Pierceove in druge nove teste. Beljakovine v raztopinah imajo maksimum pri 280 nm zaradi aminokislin z aromatskimi obroči in minimum pri približno 220 nm zaradi prisotnosti peptidnih vezi.
Koncentracija se izračuna po Warburgovi formuli:
Koncentracija beljakovin (mg/ml) = 1,55 X (odčitek A280) - 0,76 X (odčitek A260)
Če želite izvedeti več o analizi DNK s spektroskopijo UV Vis, prenesite uredniško besedilo aplikacije "Razmerje 260/280: Vključite se v poglavje "Kazalnik kontaminacije z beljakovinami".
Katere so najpogostejše napake pri meritvah in kalibraciji UV-vida?
Dobro natančnost in točnost pri meritvah UV Vis je mogoče doseči s previdnostnimi ukrepi za preprečevanje napak. Tipična tveganja za napake, ki jih je treba upoštevati pri meritvah UV Vis, vključujejo:
Spektralne značilnosti. Spektralna karakteristika se izvede med postopkom umerjanja. Glavni dejavniki, ki lahko privedejo do napačnih rezultatov, so natančnost valovne dolžine, spektralna pasovna širina, razpršena svetloba in linearnost.
Fotometrične značilnosti. Fotometrične značilnosti vključujejo spektralno občutljivost svetlobnega vira, temperaturno odvisno občutljivost svetlobnega vira in detektorja itd.
Optične interakcije. Sevanja svetlobnega vira lahko vplivajo na material kivete in spremenijo intenzivnost absorpcije vzorca. Takšnim optičnim interakcijam se lahko izognemo z izbiro ustreznega materiala kivete.
Različni dejavniki. Na meritve negativno vplivajo tudi drugi dejavniki, kot so temperatura, nihanje omrežne napetosti, vibracije, onesnaženje ali segrevanje vzorca s fotometrom.
GUVP™
Čeprav se vsem napakam ni mogoče izogniti, jih je mogoče zmanjšati in tako doseči boljše rezultate.
'Prenesite si brošuro o dobri praksi UV/VIS "Zaupanja vredni rezultati za UV/Vis spektroskopijo".
Izbira prave kivete vključuje izbiro pravega materiala in pravilne velikosti glede na vzorec in instrumentarij.
Material kivete mora imeti zadostno prepustnost pri določeni valovni dolžini. Slabljenje svetlobe na stenah kivete ne sme vplivati na rezultat analize. Steklene kivete se ne uporabljajo v UV območju za analizo pod 370 nm, ker absorbirajo sevanje. Priporočljivo jih je uporabljati le v vidnem območju.
Naslednja tabela prikazuje uporabna območja prenosa kivet:
Material
Teoretično območje prepustnosti (nm)
Kremen za daljno UV svetlobo
170-2700
Optično steklo
320-2500
Kremen blizu IR
220-3800
UV silicijev dioksid
220-2500
UV plastika
220-900
PS celica za enkratno uporabo
340-750
PMMA celica za enkratno uporabo
285-750
Velikost kivet prav tako vpliva na merilne zmogljivosti. Nazivna dolžina sevalne poti kivete je 10 mm. Odvisno od vzorcev se lahko dolžina spreminja od 1 mm do 100 mm.
Standardne kivete se lahko uporabljajo za večino preučevanih vzorcev. Običajne absorpcijske in fluorescenčne kivete imajo zunanjo osnovo 12,5 mm x 12,5 mm, višino 45 mm in notranje mere 10 mm x 10 mm.
Kivete zdolgo potjo (kivete z dolžino poti več kot 10 mm) se uporabljajo, kadar je vzorec preveč razredčen ali kadar vzorec med merjenjem izhlapeva ali doživlja kemične spremembe.
Kivete skratko potjo (kivete z dolžino poti manj kot 10 mm) se uporabljajo, kadar je absorpcija visoka in je redčenje težavno.
Kako pravilno ravnati s kivetami?
Pri ravnanju s kiveto jo vedno nosite z matiranimi stranicami. S prsti se ne dotikajte prozornih optičnih površin, saj lahko prstni odtisi povzročijo znatno absorpcijo in s tem vplivajo na natančnost.
Za polnjenje kivete ne uporabljajte steklenih pasteurjevih pipet, saj lahko optično površino opraskajo in povzročijo dodatne motnje. Priporočljive so pipete s plastičnimi konicami za enkratno uporabo.
Čistoča kivet močno vpliva na rezultate, zato moramo to upoštevati kot zelo pomemben dejavnik.
Za temeljito čiščenje kvarčnih kivet so priporočljivi naslednji koraki:
Kivete namočite v čistilno raztopino.
Odstranite čistilno raztopino in kivete sperite z deionizirano vodo.
Kivete sperite z etanolom ali acetonom, razen v primeru proteinov (glejte spodnjo preglednico).
Kivete posušite tako, da jih obrišete z robčkom, ki ne pušča vlaken, nato pa posušite na zraku ali v sušilniku.
Naslednja tabela prikazuje uporabna območja prenosa kivet.
Vodne raztopine
Organske molekule
Težko odstranljivi delci
Beljakovine
Težke kovine
Maščobne kisline
Raztopine za čiščenje
Enaki volumski deli 3 M HCl in etanola
Spiranje s 50-odstotno dušikovo kislino
Koncentriran HNO3 ali 2 M HCl
Enaki prostorninski deli etanola in 3 M HCl
Inkubiramo pri sobni temperaturi z tripsinom
(Etanol in aceton nista priporočljiva za čiščenje.)
Enak volumenski del žveplove kisline 2 M in 50 % deionizirane vode
Aqua regia
Enaki volumski deli IPA in deionizirane vode
Čas namakanja*
10 minut
10 minut
30 sekund
Čez noč
20 minut
Brisanje
*Čas namakanja, naveden v tabeli, je groba ocena; vendar je priporočljivo, da kivete namakate le, dokler se madeži/onesnaževala ne odstranijo.
Steklene kivete lahko očistite tako, da jih sperete z acetonom ali etanolom in nato sperete z vodo. Priporočljivo je sušenje na zraku.
Plastične kivete lahko večkrat sperete z deionizirano vodo. Plastičnih kivet ni priporočljivo prati s kemikalijami.
Prenesite našo zbirko plakatov z nasveti in triki za ohranjanje čistoče laboratorijskih instrumentov
Dobra praksa za uporabo spektrofotometrov za mikro volumne
Priprava vzorca Občutljivost instrumenta je lahko pri razredčenih koncentracijah bioloških vzorcev nizka. Če želite povečati občutljivost takih vzorcev, razmislite o večji koncentraciji vzorca. Za meritve mikro volumna običajno potrebujemo 1-2 µl volumna vzorca. Za odvzem vzorca uporabite umerjene pipete. Paziti je treba, da se pripravi homogen vzorec, ki se vzame za analizo.
Očistite platformo za merjenje mikro volumnov Prepričajte se, da sta površina podstavka za mikro prostornino in ogledalo ustrezno očiščena. Površini preprosto obrišite z deionizirano vodo z robčkom, ki ne pušča vlaken. Če uporabljate raztopino pufra, detergente ali lepljiv vzorec, površino očistite večkrat, preden nadaljujete z naslednjim vzorcem.
Postavite vzorec na platformo Vzorec počasi in enakomerno položite na površino, da se izognete nastajanju mehurčkov.
Delujte v mejah zaznavnosti Poznajte najnižjo in najvišjo mejo zaznavnosti instrumenta in delujte v tem območju.
Splošne prakse za natančne meritve UV-visa
Pri pripravi vzorca in pipetiranju v kiveto ali na mikrokiveto bodite previdni. Vzorec mora biti homogen.
Če so v vzorcu prisotni suspendirani trdni delci, se lahko svetloba razprši. V takih primerih vzorec filtrirajte s filtrom v brizgalki.
Vzorec napolnite v kiveto, pri čemer upoštevajte z-razsežnost držala za vzorec. To bo zagotovilo, da svetloba prehaja skozi vzorec. z-dimenzija je razdalja od dna kivete do višine, na kateri svetlobni žarek prehaja skozi vzorec.
Pred vsako meritvijo očistite kiveto s krpico, ki ne pušča vlaken. Vsakič uporabite novo krpico.
Kot slepi vzorec uporabite isto topilo/raztopni pufr, ki ste ga uporabili pri pripravi vzorca.
6. Kakšne so aplikacije UV Vis spektroskopije v različnih panogah?
UV Vis spektroskopija je vsestranska analitična tehnika s širokim spektrom uporabe v različnih industrijah. Nekatere od pomembnih aplikacij UV Vis spektroskopije v različnih industrijah so:
Hrana in pijača
UV Vis spektroskopija omogoča ugotavljanje kakovosti in sestave živil in pijač. Uporablja se lahko za analizo barve (npr. vina), okusa in arome živilskih izdelkov ter za ugotavljanje prisotnosti onesnaževalcev ali ponarejevalcev.
Farmacevtska industrija
UV Vis spektroskopija omogoča analizo čistosti, koncentracije in identitete zdravil in drugih farmacevtskih izdelkov. Uporablja se tudi za spremljanje stabilnosti farmacevtskih izdelkov skozi čas.
Kozmetika
Ocenjevanje fotostabilnosti sredstev za formulacije, karakterizacija delcev sredstva za blokiranje UV žarkov, ocenjevanje barvnega indeksa, odkrivanje ponarejanja (parfumska industrija), preučevanje optičnih lastnosti, kvantifikacija barvil, antioksidantov itd.
Petrokemična industrija
Karakterizacija surove nafte, izračun asfaltnih frakcij, oblikovanje indeksov za vsebnost aromatskih snovi, težnost kakovosti surove nafte, vsebnost žvepla, izračun Hildebrandovega faktorja topnosti (razširjeno na bitumen, težka olja in olja iz skrilavca ter olja iz fluidnega katalitskega krekinga, koksanja ali utekočinjanja premoga).
Kemična industrija
Določanje kemijskih lastnosti, končna ocena kakovosti končnega izdelka, študija sestave polimerov, kvalifikacija odpadne vode, določanje čistosti in učinkovitosti barvanja, fotokatalitska razgradnja polimerov/barvil, ostanki pesticidov v zemlji ali vodi
Biotehnologija
Koncentracija in čistost nukleinske kisline, proteinov (A280, BCA, Biuret, Bradford Lowry, OD 600), meritve mikrobnih celičnih kultur, denaturacija proteinov, kinetične študije (encimska aktivnost), biološki vzorci, kot so kri, plazma, serum itd.
METTLER TOLEDO ponuja široko paleto validiranih metod uporabe. V našem spletnem iskalniku poiščite aplikacijo, ki najbolj ustreza vašim potrebam.
Različne spektroskopske tehnike se razlikujejo predvsem po sevanju, ki ga uporabljajo, interakciji med energijo in materialom ter vrsti materiala in aplikacijah, za katere se uporabljajo. Spektroskopske tehnike, ki se običajno uporabljajo za kemijsko analizo, so atomska spektroskopija, ultravijolična in vidna spektroskopija (UV Vis spektroskopija), infrardeča spektroskopija, Ramanova spektroskopija in jedrska magnetna resonanca.
Vrsta spektroskopije
Vrsta sevanja
Interakcije
Valovna dolžina
ϒ-žarkovna spektroskopija
ϒ-žarki
Atomska jedra
< 0,1 nm
Rentgenska fluorescenčna spektroskopija
Žarki X
Elektroni notranje lupine
0,01-2,0 nm
Vakuumska UV-spektroskopija
Ultravijolična (UV)
Ionizacija
2,0 - 200 nm
UV Vis spektroskopija
UV Vis
Valenčni elektroni
200 - 800 nm
Infrardeča in Ramanova spektroskopija
Infrardeča
Molekularne vibracije
0,8 - 300 mm
Mikrovalovna spektroskopija
Mikrovalovi
Molekularne rotacije
1 mm do 30 cm
Spektroskopija z elektronsko spinsko resonanco
Elektronski spin
Spektroskopija z jedrsko magnetno resonanco
Radijski valovi
Jedrski spin
0.6 - 10 m
Katere so različne molekularne interakcije v UV območju?
Absorpcija UV-svetlobe povzroči elektronske prehode z nižjih energijskih nivojev na višje energijske nivoje. Absorpcija ultravijoličnega sevanja v organskih molekulah je omejena na nekatere funkcionalne skupine (kromofore), ki vsebujejo valenčne elektrone z nizko ekscitacijsko energijo. Molekularni prehodi/interakcije, ki se zgodijo zaradi absorpcije UV sevanja, so:
π- π* (prehod iz pi v pi zvezdo) - prehod iz vezne v antivezno orbitalo
n - π* (prehod iz n v pi zvezdo) - nevezavna orbitala v nevezavno orbitalo
Ti prehodi potrebujejo nenasičeno skupino v molekuli, ki zagotavlja π-elektrone.
Prehodi σ (vezavni) v σ* (protivezavni) zahtevajo večjo energijo, zato jih ni mogoče zaznati z UV Vis spektroskopijo.
Kako funkcionalne skupine vplivajo na spektre?
Razmislite o funkcionalni skupini, ki vsebuje atome z enim ali več samotnimi elektronskimi pari, ki ne absorbirajo ultravijoličnega/vidnega sevanja. Ko pa je ta funkcionalna skupina priključena na kromofor, spremeni intenzivnost in valovno dolžino absorpcije. Ta pojav se imenuje auxokrom ali skupina za povečanje barve.
Prisotnost auxokroma povzroči položajni premik vrha ali signala na daljšo valovno dolžino, kar se imenuje batohromni ali rdeči premik. Funkcionalne skupine, ki prispevajo k batohromnim skupinam, so substituenti, kot so metilne, hidroksilne, alkoksi, halogenske in aminske skupine.
Pomožni krom, ki povzroči položajni premik vrha ali signala na krajšo valovno dolžino, se imenuje hipokromni ali modri premik. Kombinacija kromofora in pomožnega kroma se dejansko obnaša kot nov kromofor, ki ima drugačen absorpcijski maksimum (λmax). Na primer, benzen kaže λmax pri 256 nm, anilin pa λmax pri 280 nm. Zato skupina NH2 deluje kot pomožni krom in povzroči premik λmax na večjo vrednost.
Kakšna je razlika med spektralno pasovno širino in ločljivostjo pri UV-visokoločljivostni spektroskopiji?
Spektralna pasovna širina (SBW) spektrofotometra je povezana s fizično širino rež in optično disperzijo monokromatorskega sistema. Ločljivost je sposobnost instrumenta, da loči svetlobo na končna, različna območja valovnih dolžin in da loči vsako končno območje. Spektralna pasovna širina se običajno uporablja pri instrumentih za skeniranje, medtem ko se ločljivost običajno uporablja pri matričnih instrumentih.
Za večino farmakopejskih kvantitativnih namenov zadostuje spektralna pasovna širina, manjša od 2 nm, merila sprejemljivosti za razmerje pa so 1,3. Spektralna ločljivost se lahko uporablja za primerjavo s spektralno pasovno širino.
V tabeli je prikazana ločljivost spektrofotometrov UV/VIS Excellence podjetja METTLER TOLEDO, ki se meri z uporabo toluena v heksanu, in ekvivalentna SBW.
Instrument
Spektralna ločljivost
Ekvivalentna SBW (nm)
UV5
> 1.5
< 2.0
UV5Bio
> 1.5
< 2.0
UV5Nano
> 1.7
< 1.5
UV7
> 1.9
≤ 1.0
Kateri so različni viri svetlobe, ki se uporabljajo v spektrofotometru UV Vis?
Najboljši vir svetlobe je tisti, ki zagotavlja dobro intenzivnost z nizkim šumom v vseh ultravijoličnih in vidnih valovnih dolžinah ter je stabilen v daljšem časovnem obdobju. Obstaja vrsta svetlobnih virov, ki se običajno uporabljajo, kot je navedeno spodaj.
Vir svetlobe
Območje valovne dolžine
(nm)
Območje
Življenjska doba
Žarnica z volframovo nitko
350 - 2500
VIS + IR
3.000 ur
Deuterijeva obločna svetilka
190 - 400
UV
1 000 ur
Vodikova svetilka
190 - 400
UV
1 000 ur
Ksenonska bliskavica
190 - 1100
UV + VIS + NIR
5 500 ur*
* Ustreza utripanju s frekvenco 50 Hz pri stalnem delovanju
V čem je difrakcijska rešetka boljša od prizme?
Prizme in difrakcijske rešetke so tipični disperzijski elementi. Prizma doseže disperzijo zaradi razlike v lomnem količniku materiala glede na valovno dolžino. Difrakcijska rešetka pa uporablja razliko v smeri difrakcije za vsako valovno dolžino zaradi interference. Tako prizme kot difrakcijske rešetke lahko svetlobne spektre za analizo razpršijo v več barv. Vendar je difrakcijska rešetka manj občutljiva na barvo svetlobe in jo je mogoče narediti tako, da razširi barve na večji kot kot prizma. Steklo v prizmi je prozorno za vidno svetlobo, vendar absorbira in blokira svetlobo v infrardečem in ultravijoličnem delu spektra. Difrakcijska rešetka z nekaj sto črtami na palec lahko odkloni svetlobo v sredini vidnega spektra za vsaj 20 stopinj. Odklonski kot steklene prizme je običajno veliko manjši od tega.
Katere anorganske spojine lahko merimo z UV Vis spektroskopijo?
Molekule je mogoče analizirati z UV Vis spektroskopijo, če imajo katero koli funkcionalno skupino ali konjugacijo ali če tvorijo barvni kompleks. Ker anorganske spojine ne vsebujejo nobene funkcionalne skupine ali konjugacije, je običajna metoda za njihovo analizo reakcija z ustrezno spojino. Pri tem nastane barvni kompleks, katerega absorbanco lahko fotometrično izmerimo v vidnem območju in jo povežemo z njegovo dejansko koncentracijo. Na primer, železo se običajno analizira z reakcijo z 1,10-fentrolinom, pri čemer nastane rdeč barvni kompleks. Absorbanco kompleksa izmerimo pri valovni dolžini 570 nm, da ocenimo koncentracijo železa.
Kako se razlikujeta spektrofotometra z enim in dvema snopoma?
Glavna razlika med spektrofotometrom z enim in dvema snopoma je naslednja.
Enosnopni spektrofotometer: En sam žarek iz vira svetlobe prehaja skozi vzorec.
Spektrofotometer z dvojnim snopom: Svetlobni žarek iz svetlobnega vira se razdeli na dva dela: en del gre skozi vzorec, drugi del pa skozi referenco.
Razdelitev žarka v spektrofotometru z dvojnim žarkom se doseže na dva načina:
statično, z delno prepustnimi zrcali ali podobno napravo
z dušenjem žarkov s premičnimi optičnimi in mehanskimi napravami
Kako analizirati trdno polimerno folijo z uporabo UV Vis?
Analiza trdnega vzorca se izvaja predvsem z ocenjevanjem njegove absorbance, transmitance in odbojnosti. Običajni parametri, ki se določajo za trdne polimere, so % prepustnosti, mejna valovna dolžina in indeks rumenosti. Vzorec se namesti na držalo, ki je posebej zasnovano za trdne vzorce, odčitki pa se opravijo na enak način kot pri tekočih vzorcih. Držalo za trdne vzorce omogoča merjenje trdnih vzorcev, kot so filmi ali steklo.
Ali temperatura vpliva na analizo UV-vida?
Temperatura vpliva na vrednosti absorbance. Različna topila pri različnih temperaturah različno reagirajo. Parametri raztopine, ki se spremenijo zaradi temperaturnih sprememb, so:
Hitrost reakcije. Hitrost se spremeni, ko se temperatura zviša. To lahko povzroči spremembo aktivnosti vzorca. Encimske/biomolekularne reakcije so zelo občutljive na temperaturo.
Topnost topljenca. Na topnost vplivajo spremembe temperature. Slaba topnost lahko povzroči nenatančno absorpcijo.
Raztezanje ali krčenje topila. To lahko povzroči spremembo koncentracije raztopine in vpliva na absorpcijo, saj je absorpcija linearno povezana s koncentracijo.
Schlierenov učinek. Ta učinek se lahko pojavi pri temperaturnih spremembah, kar povzroči vrsto konvekcijskih tokov, ki lahko spremenijo pravo absorbanco.
Na parametre optičnega delovanja, kot so fotometrični šum, natančnost/ponovljivost valovne dolžine, fotometrična ponovljivost in razpršena svetloba, temperatura v območju od 10 do 40 °C ne vpliva.
Optični parametri, kot sta fotometrična ločljivost (razmerje toluen/heksan) in fotometrična natančnost valovne dolžine (K2Cr2O7 v HClO4), pa so odvisni od temperature, in sicer od 0,014 do -0,034/enoto v območju od 10 do 40 °C.
Temperaturni nadzor za UV Vis spektrofotometrijo je mogoče doseči z visoko zmogljivimi termostatskimi sistemi, kot sta CuveT in CuvetteChanger. Več informacij najdete tukaj.
Kaj je razpršena svetloba?
Razpršena svetloba je opredeljena kot svetloba, ki pride do detektorja in ne prihaja iz svetlobnega vira instrumenta ter ne sledi optični poti, kar povzroči odstopanje pri ustrezni valovni dolžini. Zato je jakost svetlobe, ki jo izmeri detektor, večja, kot bi dejansko morala biti. Obratno pa to pomeni tudi, da je izmerjena absorbcija nižja od prave absorbcije, ker je zmanjšana zaradi prispevka blodeče svetlobe. Ta učinek je izrazitejši pri višjih vrednostih absorbance (visoke koncentracije vzorca).
Če želite izvedeti več o izvoru in natančnem merjenju razpršene svetlobe, prenesite beli papir:
Zakaj je prostor za vzorec v spektrofotometrih UV Vis Array odprt?
Predel za vzorec v spektrofotometrih z matriko UV Vis je odprt, ker instrumenti z matriko uporabljajo obratno optiko in hkratno zaznavanje vseh valovnih dolžin v spektru.
Obratna optika: Svetloba se po prehodu skozi vzorec razprši. Zaradi tega le majhen del zunanje svetlobe iz okolja prispeva k signalu v določenem območju valovnih dolžin.
Hkratno zaznavanje: S pomočjo detektorja z matriko, ki zagotavlja 2048 signalov jakosti svetlobe hkrati, je celoten spekter zabeležen v eni sekundi. Ker je meritev zelo hitra, je učinek svetlobe iz okolice bistveno manjši.
Aplikacije
Spodaj si prenesite posebne priročnike za uporabo za UV Vis spektroskopijo
V eni enoti združuje dva instrumenta, in sicer za merjenje mikroprostornin in standardnih 1-centimetrskih kivet pri raziskavah na področju naravoslovnih znanosti.
Zahtevajte ponudbo ali informacijePridobite ponudboTakojšnja ponudbaInformacije o rešitviRequest Online Demo
