바이오 촉매 (Biocatalysis) | 효소 촉매

바이오 촉매 또는 효소 촉매는 생물 활성 성분을 사용하여 화학적 변환을 촉진시킵니다. 바이오 촉매는 세포가 없는 완전한 시험관 내에서 살아있는 세포 배양의 발효 매개 공정에 이르는 다양한 환경에서 발생하는 일차 탄소 중심 반응의 스펙트럼을 촉진합니다.

바이오 촉매는 여러 가지 이유로 전통적인 화학 촉매에 대한 유용한 대안적인 촉매를 대표합니다. 효소 관련 바이오 촉매 반응의 특징:

• 높은 화학적, 위치 선택적 및 enantiospecific 특이성
• 종종 빠른 역학
• 화학 촉매보다 약한 조건에서 작동
• 금속 촉매의 폐기물, 독성 및 비용 관련 문제 해결
• 화학 반응과 관련된 에너지 필요를 감소시킴

바이오 촉매로 유도된 공정은 높은 온도에서 용매의 안정성을 향상시켜 제약, 화학, 바이오 연료 및 식품 산업에 바이오 촉매를 광범위하게 도입하는 데 기여합니다.

바이오 촉매는 “친환경”, 즉 지속 가능하고 비용 효율적인 화학 제품의 제조와 관련이 있습니다. 화학 촉매에 비해 바이오 촉매는 합성에 대해 다음과 같은 고유한 이점을 제공합니다.

• 광범위한 화학적 전환을 해결하기 위해 자연적 또는 유전적으로 조작된 원료에서 상당한 화합물 다양성
• 블로킹/디블로킹 그룹의 사용, 거울상 이성질 혼합물의 분리 및 바람직하지 않은 부산물을 제거하기 위한 작업과 같이 특정한 전형적인 화학 합성/처리 전략의 필요성을 완화하는 바이오 촉매 반응의 특이성
• 많은 바이오 촉매 공정은 단일 포트 반응에서 수행될 수 있기 때문에 일반적인 화학 촉매가 요구하는 반응 단계를 제거할 수 있다는 점에 근거하여 인프라와 원료 요건의 단순화가 이뤄집니다.  

바이오 촉매에 사용되는 효소는 다음을 포함하는 중요하고 빈번하게 사용되는 기능을 가지고 있습니다.

A) 다른 바이오 의약품 또는 저분자의 작용기 또는 위치 특이적 결합 및 표적 인식

B) 다른 바이오 의약품 또는 저분자의 결합 또는 변위를 촉진

C) 이온 운반을 촉진하는 구조적 또는 정전기적 특징

D) 질서에서 무질서로의 구조적 변환과 그로 인한 다양한 촉매 활동

E) 효소 활성을 유도 또는 억제하는 알로스테릭 또는 간접적 변형

향상되거나 변형된 재조합 바이오 촉매에 대한 연구는 열악한 화학 분야에서 그 활용성을 계속 확장하고, 반응 범위, 효소의 견고성 및 재사용성을 개선시킵니다. 현재 C-C 결합, 아미드 결합, 키랄아민 생성 및 C-H 기능화와 같은 주요한 화학적 변환을 수행하는 데 천연 및 조작된 바이오 촉매를 사용할 수 있습니다.

생체 내 변환(biotransformation)에 사용되는 효소의 범위는 식품, 제약, 섬유, 바이오 연료, 제지, 화학 약품 및 가정용 제품을 비롯해 매우 광범위하며 실제로 이 모든 산업 분야에 걸쳐 교차되고 있습니다. 바이오 촉매(즉, 효소 촉매 또는 효소 매개 촉매)는 정밀 화학 제품, 제약 및 관련 중간 생성물의 합성에서 핵심 지원 기술로서 급성장하고 있습니다. 산화, 환원, 첨가 및 제거와 같은 다양한 생체 내 변환에 효소가 사용될 수 있습니다. 

효소의 6가지 주요 class 및 application 예시: 

1. 산환 환원 효소(oxidoreductase)는 분자의 산화 및 환원을 촉진시킵니다. 산소 분자를 이용한 단일 산화효소는 C-O 결합 형성을 가능하게 하고 특이적 효소를 조작하여 알코올, 케톤, 알데히드 및 아민의 산화를 가능하게 합니다. 환원과 관련하여, 케톤 환원효소(KREDS)와 탈수소효소는 enantiospecific 알코올의 합성을 가능하게 합니다. 그 밖의 효소는 C=N과 같은 결합을 환원시켜 나이트릴을 아민으로 변화시킵니다. 

2. 전이 효소(transferase)는 한 분자에서 다른 분자로 작용기를 전이하는 데 유용합니다. 인산화 효소 및 인산 분해 효소(인산염의 첨가 및 제거)는 분자 신호전달 연쇄반응, DNA 복제, RNA 전사 및 기타 기능에 있어서 특히 중요합니다. 또한 케톤 또는 알데히드의 아민으로의 전환과 같은 기능을 하고 입체 선택적인 기능을 할 수 있는 생물학적으로 중요한 전이효소가 많습니다.

3. 가수분해효소(hydrolase)는 다양한 기질의 가수 분해를 촉진합니다. 핵산 분해효소(nuclease) 또는 프로테아제(protease)는 핵산 및 펩티드 재생 시에 풍부하며 필수적인 기능을 합니다. 리파아제, 프로테아제 및 아실라아제와 같은 가수 분해효소는 C-C 결합 및 탄소-헤테로원자 결합을 형성하는 데 광범위하게 사용되는 Michael 1,4-addition에 대한 촉매로 작용합니다.

4. 분해 효소(lyase)는 일반적으로 이중 결합의 형성 또는 제거를 통해 반응을 촉진합니다. 가수분해효소의 치환반응과는 달리, 카르복실라아제 또는 탈카르복실라아제 반응은 CO의₂의 첨가 또는 제거를 위한 제약 분야의 바이오 촉매반응에서 일반적으로 나타나며, 이는 치환된 아스파트산 및 알라닌을 포함하는 아미노산을 생성하는 데에 사용될 수 있는 C-N 분해효소와 유사합니다.

5. 이성질화 효소(isomerase)는 분자 내 원자들의 재배열을 가능하게 합니다. 라세미화 효소와 같은 이성질화 효소는 표적 키랄 탄소에서 입체화학을 도치시키고 시스-트랜스(cis-trans) 이성질화 효소는 알켄 또는 시클로알칸의 시스-트랜스 이성질체의 이성질화를 촉진합니다. 포도당 이성화 효소를 통해 과당으로의 포도당 전환은 산업의 주요한 효소 생체 내 변환을 대표합니다.

6. 리가아제(ligase), 즉 연결 효소는 더 큰 분자를 형성하기 위해 두 개의 분자를 결합함으로써 새로운 화학 결합을 형성합니다. 재조합 DNA 분자를 형성하는 데에 DNA 연결 효소를 사용하는 것과 핵속핵산분해효소(endonuclease) 또는 핵산말단분해효소(exonuclease)에 대한 보완이 가장 중요한 Application 중 하나에 해당합니다.

효소 촉매 생산. 일반적으로 바이오 촉매를 위한 천연 또는 재조합 효소는 먼저 박테리아를 사용한 발효를 통해서 합성되지만 때때로 효모 배양을 통해서도 유도됩니다. 효소가 보다 복잡한 포유류 세포 배지에서 생성될 수 있지만, 박테리아와 효모에는 일반적으로 충분한 자연발생 분자 경로가 포함되어 있어서 재조합 바이오 촉매 효소를 필요로 하는 접힘 및 중간 수준의 번역 후 변형을 달성할 수 있습니다. 이러한 발효를 통해서 생성된 효소는 일반적으로 세포 구조물의 용해 또는 그 밖의 분해에 의해서 수집되어 재조합 효소를 분비하고 기타 바이오 의약품 및 제약과 유사한 공정에서 추가적으로 정화됩니다. 발효, 수집 및 다운스트림 공정은 자체적인 도전 과제가 있으며 이는 공정 분석 기술(PAT)을 사용함으로써 해결할 수 있습니다.

안정화 및 고정화. 효소 고정화는 보다 안정되고 활성이 있으며 재사용 가능한 효소를 생성하는 데 사용됩니다. 일반적으로 교차 결합 효소 응집(CLEA)은 실리카, 수지 또는 PEG와 같은 폴리머 및 심지어 지질 나노입자(LNP)와 같은 기타 복합체를 포함하여 많은 다양한 고체 기질로 형성될 수 있습니다. 일부 유동 화학 Application의 경우, CLEA는 표면에서 또는 촉매 용도뿐만 아니라 촉매 용도로 표면 강화 측정에 사용되는 것과 같은 센서에서 형성될 수 있습니다. 제품 안정성 및 제형 뿐만 아니라 관련 성분의 합성, 흡수, 접합 또는 기타 결합에 있어서의 문제는 백신 제형 및 보조제 공정을 위한 유사한 솔루션으로 해결합니다.

제품 캡처 및 분리. 바이오 촉매 후에 CLEA를 제품과 잔여 반응물에서 분리하고 그 다음에 재활용하거나 다른 경우 보유합니다. 그 다음 저분자 제품은 여과와 크로마토그래피 공정을 통해서 분리될 수 있으나, 많은 공정은 결정화 방법을 계속해서 촉진시킵니다. 고분자 바이오 촉매 생성물은 일반적으로 일반적인 다운스트림 공정 작업흐름을 유지합니다.

적절한 바이오 촉매 프로토콜의 설계에 있어서 모든 유리 효소, 기질 결합 효소 또는 표면 고정 효소의 실질적인 반감기 및 안정성을 이해하는 것은 중요할 수 있습니다. 고려 사항은 다음과 같습니다.

• 용매 - 많은 천연 효소는 유지 용매 반응에 작용하는 데 어려움을 겪습니다. 조작되거나 재조합 효소의 계속 진화하는 프로필은 유기 용매 조건의 상호 호환성을 향상시키고 있습니다. 예를 들어 현재 재조합 효소는 유기 용매 환경에서 촉매 반응을 일으킬 수 있어서 올리고뉴클레오타이드 합성에서 변형된 포스포라미다이트(phosphoramidite)를 사용할 수 있습니다.
• pH - 효소는 일반적으로 좁은 pH 범위에서 가장 우수하게 작용하고 pH 변동 <0.5pH 단위를 허용합니다. 따라서 pH 제어는 종종 많은 바이오 촉매 반응을 고려하기 위한 주요한 파라미터이고 이를 수동으로 조절하는 것을 어렵거나 지루할 수 있습니다. 
• 온도 - 천연 효소 및 그 재조합 효소는 상당히 좁은 범위의 특정한 온도에서 효율적으로 기능합니다. 온도 편차는 반응 역학, 제품 수율 또는 기타 주요한 공정 결과의 변화를 야기할 수 있습니다.
• 용존 산소 - 이러한 주요한 공정 파라미터는 특히 산소화 및 환원 반응에 중요한 것으로 일반적으로 산소 및 불활성 기체의 살포 또는 헤드 공간에서 조절됩니다. 산화 환원 효소가 가장 효율성있게 기능할 수 있도록 보장하기 위해서 용존 산소량과 반응 혼합물로의 용존 산소(기포 특징 포함)의 질량 전달을 최적화하는 것이 중요합니다.
• 혼합, 유체 역학 및 기체 - 적절한 혼합 장치는 특히 장기간, 유동 화학 또는 관류 방식의 실행 동안 바이오 촉매 효소의 수명 주기에 많은 효과를 줄 수 있습니다. 혼합의 특성이 충분히 규명되지 않은 경우 바이오 촉매 반응의 스케일업은 부적절할 수 있습니다. 또한 혼합은 기체의 적절한 분산과 질량 전달에 중요합니다.
• Reaction Stoichiometry - 시약 대 효소의 정확한 비율은 매우 중요하며 이 비율은 시험 설계(DoE) 연구로 결정되고 화학 반응기에 의해 자동화되고 공정 개발에 통합된 PAT의 지원을 받을 수 있습니다.

바이오 촉매 반응의 개발과 스케일업은 사용된 특정한 바이오 촉매, 기질, 공동 계수 및 적용된 반응 조건의 특징에 기반합니다. 화학 분석의 경우와 마찬가지로, 변수의 이처럼 복잡하고 상호 의존적인 매트릭스는 실시간 분석 측정의 정보와 결합했을 때 반응 변수의 주의 깊은 조절을 통해서 가장 잘 이해할 수 있습니다. 하지만 최신 공정을 위한 공정 개발, 확장 및 데이터 밀도 제한의 상당 부분은 바이오 촉매 반응의 지속적인 수동 방향 조절과 관련하여 시간과 자원 비용을 필요로 합니다. 수동 작동은 공정 특성화 및 기술 이전에 대해 증가하는 규정과 제도적 요구사항에 부합하기 위해, 바이오리액터에 거의 지속적인 관리, 조정 및 샘플링을 위한 인력이 상주해야 하는 것을 의미합니다.

바이오 촉매의 무인 작동은 통합된 센서와 공정 분석 기술(PAT)을 통해 지속적으로 측정된 역학 반응 조건에 반응하는 실험실 자동화 플랫폼으로 수행 가능합니다. 자동 합성 반응기 플랫폼은 최소화된 인적 오류와 개입을 통해서 보다 신속한 실험을 촉진합니다. 오프라인 크로마토그래피 분석을 위한 모듈식 자동 반응기가 결합된 모든 주요 공정 파라미터(CPP)는 덮어 쓰고 추세화될 수 있습니다. 파라미터 제어 및 공정 분석 데이터는 실시간으로 자동 기록되고 데이터 관리 및 보관을 위해 구조화됩니다. 다양한 반응기 규모 전반에서 실험 변동성의 감소와 재현성의 증가는 추가적으로 증거 기반의 스케일업을 능률화합니다.

• EasyMax 및 OptiMax 자동 반응기는 온도, pH, 혼합 속도 및 분주와 같은 주요 생체 내 변환의 변수에 대한 영향을 정밀하게 조절하고 효과적으로 모델링하고 기록하는 것을 보장하는 데 중요한 역할을 합니다.
• ReactIR 및 ReactRaman 현장(In-situ) 분광분석 기술은 실시간으로 주요한 반응 종류를 추적하고 측정하는 데 유용합니다. ReactIR은 전체 세포와 같이 부유된 입자로 인한 측정 방해 요소 없이 용액 내 주요 분석물을 추적합니다.
• FBRM 기술을 이용하는 ParticleTrack은 불균일 부유액의 입자 크기 및 입도 분포를 측정합니다.EasyViewer는 입자의 현장(In-situ) 이미지를 캡처하고 시스템 탁도, 모양, 크기, 형태, 개수 및 분포에 대한 실시간 이미지 분석을 수행합니다.
• EasySampler는 오프라인 분석 준비 시에 샘플의 퀀칭 및 희석을 포함하여 화학 반응의 완전 자동화 및 무인 샘플링을 가능하게 합니다.

EasyMax 자동 반응기는 개발, 확장 및 수행을 지원하기 위한 바이오 촉매의 파라미터 최적화를 위한 완벽한 워크스테이션입니다. 이 완전 자동 시스템은 공정 파라미터에 대한 정확한 통제를 가능하게 합니다.

• 원료 물질의 확인, 분주 속도, 온도, 교반, 헤드 공간, 주입, pH 측정 및 적정을 포함하는 CPP를 관리합니다.
• ReactIR(FTIR), ReactRaman(Raman), ParticleTrack(FBRM), EasyViewer(현장 이미지 분석) 및 EasySampler(자동화된 현장 반응기 샘플링)를 포함하는 현장(In-situ) 분석 방법과 쉽게 통합됩니다.
• 무인 상태에서 실험을 실행하고 오프라인 분석이 필요할 경우 지능형 자동화 샘플링을 수행합니다.
• iC Software를 통해 모든 실험과 주변 장비 뿐만 아니라 철저한 데이터 기록 및 기록 추적을 자동 실행하고 관리할 수 있습니다.

ReactIR은 FTIR 분광법을 사용하여 바이오 촉매 연구에서 수용성 및 유기 가용성 성분을 측정합니다. ReactIR 측정은 부유 물질, 기포 또는 기타 입자 질량에 영향을 받지 않습니다.

ReactRaman은 Raman 분광법을 사용하여 입자의 분자 분석 및 반응 분석을 제공합니다.

• 용기 또는 흐름 공정 스트림에 현장에서 실시간으로 제품 품질의 여러 가지 속성을 모니터링
• 채취 샘플과 관련된 지연 제거
• 제품 수율과 공정 효율에 관한 공정 단계의 영향을 정량화
• 실시간 의사결정과 관리를 위해 실용적인 데이터 분석 제공
• 데이터가 풍부한 실험과 디지털화를 통해 ICH 규제 가이드라인 제공
• R&D에서 제조까지 스케일업 지원
• 부피가 최하 500ppm인 분석물의 농도를 몇 밀리미터에서 수천 리터까지 측정

ParticleTrack은 FBRM(Focused Beam Reflectance Measurement) 기술을 사용하며 이는 광학 프로브 기반 장비로서 용기에 직접 삽입되어 입자 크기와 개수 변화를 실시간으로 추적합니다. ParticleTrack은 입도 분포(PSD)를 획득하기 위해 현 길이 분포(CLD) 측정을 사용합니다.

• 실험 조건 및 파라미터가 다양하므로 입자와 입자 구조를 지속적으로 모니터링합니다.
• 고체상 입자 합성, 효소 고정, 절단 및 관련 공정 형태의 특성을 규정합니다.
• 실시간 바이오 촉매 동안 샘플을 제거할 필요없이 바이오 촉매 생성물의 배치 또는 지속적인 성장을 추적합니다.
• 핵 형성, 침전, 다형성 및 기타 시스템 속성에 영향을 주는 입자 시스템 조건을 특성화합니다.

EasyViewer는 프로브 기반 입도 분석기로 용기에 직접 삽입되어 입자 시스템의 이미지를 캡처합니다. EasyViewer는 영상 분석을 수행하고 시간 경과에 따라 군집들의 추이를 파악할 수 있는 공정에 대한 시간에 따른 인라인 영상에서 입자 개수, 입도 분포 및 형태를 측정합니다.

• 실험 조건 및 파라미터가 다양하므로 입자와 입자 구조를 지속적으로 모니터링합니다.
• 고체상 입자 합성, 효소 고정, 절단 및 관련 공정 형태의 특성을 규정합니다.
• 버블 특성화를 통한 물질 전달 (K_La) 측정
• 실시간 결정화 동안 샘플을 제거할 필요없이 바이오 촉매 생성물의 배치 또는 지속적인 성장을 추적합니다.
• 핵 형성, 침전, 다형성 및 기타 시스템 속성에 영향을 주는 입자 시스템 조건을 특성화합니다.

ReactIR Provides Insight into Optimizing the Synthesis of the Ester

Allsop, G. L., Carey, J. S., Joshi, S., Leong, P., & Mirata, M. A. (2021). Process Development toward a Pro-Drug of R-Baclofen. Organic Process Research & Development, 25(1), 136–147

복잡한 분자의 개발 과정 중에 화학 전문가들은 다단계 합성을 단순화하는 방법을 추구합니다. 효소를 촉매 및 라세미 화합물의 분해에서 사용하는 것은 확실히 정립되어 있습니다. 현장(In-situ) 분석 기법은 상호 보완적이어서 개별적인 합성 단계의 화학 및 생화학적 변환을 최적화하는 것을 보조하는 데 매우 유용합니다.

이러한 작업에서 연구자들은 알코올 남용 질환에 사용되는 약물인 아바클로펜 플라카빌(arbaclofen placarbil)에 대한 수 킬로그램의 합성 개발에 참여했습니다. 일 단계는 주요한 숙신산 에스테르 중간 생성물 화합물의 합성과 에스테르가 단일 (S)-이성질체로 후속적으로 분해에 관한 것입니다. 충분한 양의 단일 이성질체를 획득하기 위해 연구자들은 두 가지의 다른 접근방식인 예비 키랄 크로마토그래피와 효소 분해를 탐색합니다. 후자의 접근방식이 유리한 것으로 간주되었으며, 연구자들은 폴리메타크릴레이트(IMMCALA-T2-150 리파아제)에 고정된 C. 안타르티가 A 리파아제가 분해된 에스테르 숙시네이트 중간 생성물로의 중요한 경로를 제공한다는 것을 발견했습니다.

숙신산 에스테르를 초기에 합성하기 위해, 연구자들은 유사한 티오카보네이트(thiocarbonate) 화합물이 염화황(sulfuryl chloride)과 반응하여 바람직한 에스테르가 생성되었음을 확인했습니다. 에스테르 생성을 최적화하고 부산물을 최소화하기 위해서 ReactIR을 사용했습니다. 현장 FTIR은 티오카보네이트 화합물과 염화황이 반응할 때 제한된 열 안정성을 갖는 중간 생성 화합물인 클로로폼산(chloroformate)이 형성되는 것을 보여주었습니다. 이 중간 생성물이 형성되고 분해되기 전에 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide)를 첨가한 다음 트리에틸아민(triethylamine)을 첨가합니다. 트리에틸아민을 첨가하면 높은 발열 반응이 나타나서 클로로포름산 중간 생성물이 바람직한 숙신산 에스테르로 전환됩니다.

ReactIR Tracks Key Biocarbonate Concentration

Pesci, L., Gurikov, P., Liese, A., & Kara, S. (2017). Amine-Mediated Enzymatic Carboxylation of Phenols Using CO2 as Substrate Increases Equilibrium Conversions and Reaction Rates.Biotechnology Journal, 12(12), 1700332

저자들은 디히드록시 벤조산 (탈)카르복실라아제(dihydroxybenzoic acid (de)carboxylase) 효소가 해당 화학 촉매보다 훨씬 낮은 온도와 압력에서 카르복실화를 수행하므로 그것이 페놀 수지의 가역적 위치 선택적 오르소-(탈)카르복실화를 촉진하고 상당한 관심을 갖는다는 것을 확인했습니다. 현재 연구에서 저자들은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)의 2,3-디히드록시 벤조산 (탈)카르복실라아제가 페놀 분자의 오르소-카르복실화(ortho-carboxylation)를 가능하게 하는 촉매로 작용하며, 이는 아민이 동시에 매개하는 공기질 제자리 중탄산으로의 CO₂ 변환과 관련이 있다고 발표합니다.

저자들은 기질 결합 및 활성화의 기작이 실제 카르복실화제를 결정하므로 공기질 CO₂의 특성 또는 수소화 형태 중탄산은 효소적 카르복실화에 중요하다고 언급합니다. 이들의 연구에서 다이아몬드 ATR 삽입 프로브를 장착한 ReactIR은 중탄산염의 형성을 추적하는 데에 사용되었습니다. 저자들은 이 연구 결과 반응 조건의 발전으로 카테콜의 바이오 촉매 카르복실화에 대한 전환과 반응 속도 모두 상당히 향상시킨다고 보고했습니다.

ReactIR Investigates Oxidative Coupling With Various Substrates and Aids in Optimizing Reaction Conditions

Engelmann, C., Illner, S., & Kragl, U. (2015). Laccase initiated C-C couplings: Various techniques for reaction monitoring. Process Biochemistry, 50(10), 1591–1599.

저자들은 곰팡이 효소 라카아제(Novozym 51003)를 페놀 화합물의 산화적 C-C 결합에 사용하는 연구를 보고했습니다. 라카아제는 O₂를 물로 환원하여 페놀, 아닐린 등을 퀴논으로 산화하는 적용성을 나타내었습니다. 라카아제 결합은 일반적으로 비선택적인 것으로 간주되므로 저자들은 C-C 결합의 효율성/선택성을 결정하기 위해 여러 가지 페놀 기질에서의 라카아제 산화에 대한 연구를 시작했습니다. 저자들은 2,6 이중 치환된 페놀의 산화적 이합체화는 고도로 선택적일 뿐만 아니라 상당히 확장시킬 수 있음을 확인했습니다. 저자들은 그 결과 생성된 2,6 디이소프로필 페놀(diisopropyl phenol) 산화적 생성물이 유사한 바이페놀(biphenol) 화합물로 쉽게 환원되었음을 증명했습니다.

연구자들은 이 연구에서 라카아제로 개시된 산화 중에 산소 측정을 통해 표적 기질을 초기에 선택했습니다. 그 다음 연구자들은 ReactIR(현장 FTIR 분광법)을 사용하여 특정 페놀 기질과 라카아제로 개시된 커플링 반응의 효율성 및 선택성을 조사하고 생성물을 최대화하기 위한 최적 조건을 정의했습니다. 현장 FTIR 연구에서 위치 선택적, 대칭적 diquinone 합성이 다소 빠르게 발생했음을 증명되었습니다. 더 나아가 현장 FTIR은 라카아제 산화를 통해서 발생한 중합 반응의 모니터링을 허용했으며, FTIR-ATR 방법은 용질 분석물만을 추적하기 때문에 고분자 침전물은 측정을 방해하지 않았습니다.  

• Allsop, G. L., Carey, J. S., Joshi, S., Leong, P., & Mirata, M. A. (2021). Process Development toward a Pro-Drug of R-Baclofen. Organic Process Research & Development, 25(1), 136–147. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00491
• Benkovics,T, McIntosh, J.A., Silverman, S. S., Kong, J., Maligres, P., Itoh, T., Yang, H., Huffman, M.A., Verma, D., Pan, W., Ho, H.-I., Vroom, J., Knight, A., Hurtak, J., Morris, W., Strotman, N.A., Murphy, G., Maloney, K.M., & Fier, P.S., “Evolving to an Ideal Synthesis of Molnupiravir, an Investigational Treatment for COVID‐19”, ChemRxiv, Preprint. http://doi.org/10.26434/chemrxiv.13472373.v1
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