Comprendre l'essentiel sur la spectroscopie UV Vis et ses applications
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La spectroscopie ultraviolet-visible (UV VIS) constitue une puissante technique adaptée à de nombreuses applications dans de nombreux secteurs et segments de marché.
Lorsqu'une substance absorbe l'intensité lumineuse maximale à une longueur d'onde spécifique, cela indique qu'il existe une relation unique entre cette substance et le spectre UV VIS. Cette relation permet notamment de réaliser :
une analyse qualitative pour déterminer la présence de certaines substances. Par exemple, la détermination de la DOBI et de la teneur en carotène dans les matières grasses et les huiles alimentaires, l'identification d'une contamination, telle que la présence de chrome et de fer dans l'eau, l'identification de la cyanocobalamine et le contrôle de la pureté de l'ADN/ARN.
une analyse quantitative pour déterminer la quantité de certaines substances. Par exemple, la détermination de la concentration de substances dans l'eau, telles que la DCO ou l'ammoniac, la détermination de l'unité d'amertume des boissons alcoolisées, la mesure de la teneur en sucre des boissons et la quantification de protéines.
Sur cette page, vous allez acquérir des connaissances essentielles sur la spectroscopie UV VIS et ses applications.
Obtenez des réponses à vos questions concernant la spectroscopie UV VIS et ses applications dans les sections suivantes :
1. Principes fondamentaux de la spectroscopie UV VIS
Qu'est-ce que la spectroscopie UV VIS ?
La spectroscopie UV VIS est un type de spectroscopie à absorption au cours de laquelle l'échantillon est éclairé par des rayons électromagnétiques de différentes longueurs d'onde dans les domaines de l'ultraviolet (UV) et du visible (VIS). Selon la substance, les UV ou les rayons de lumière visible sont partiellement absorbés par l'échantillon. La lumière résiduelle, c'est-à-dire la lumière transmise, est enregistrée en fonction de la longueur d'onde par un détecteur adapté. Le détecteur génère ensuite le spectre UV VIS unique de l'échantillon (aussi connu sous le nom de spectre d'absorption).
Pour en savoir plus sur les principes fondamentaux de la spectroscopie UV VIS, téléchargez le guide METTLER TOLEDO « Applications et principes de base de la spectrophotométrie ».
Lorsque la lumière touche un objet, elle peut être absorbée par l'objet, en général car la longueur d'onde de la lumière absorbée correspond à une excitation électronique dans l'objet. La lumière résiduelle est transmise, c'est-à-dire qu'elle traverse l'objet.
Le spectrophotomètre mesure la transmission en divisant le spectre d'intensité de la lumière transmise à travers un échantillon (I0) par le spectre d'intensité de la lumière transmise à travers un blanc (I).
Convertisseur d'absorbance/de transmission
=
L'absorbance (A), aussi connue sous le nom de densité optique (DO), est la quantité de lumière absorbée par l'objet et s'exprime comme suit :
Transmission (T)
Pour en savoir plus sur les principes fondamentaux de la spectroscopie UV VIS, téléchargez le guide « Applications et principes de base de la spectrophotométrie ».
Qu'est-ce que la loi de Beer-Lambert ?
La loi de Beer-Lambert stipule que la quantité d'énergie absorbée par une solution est proportionnelle à la longueur du trajet optique et à la concentration. Pour faire simple, plus une solution est concentrée, plus elle absorbe la lumière.
En termes mathématiques, la loi de Beer-Lambert donne :
A = ϵ.d.c
Où ϵ = absorptivité molaire, d = longueur du trajet optique et c = concentration. L'absorptivité molaire est une constante physique unique de l'échantillon liée à la capacité de l'échantillon à absorber la lumière à une longueur d'onde donnée. ϵ a comme unité L·mol-1·cm-1.
Pour en savoir plus sur les principes fondamentaux de la spectroscopie UV VIS, téléchargez le guide METTLER TOLEDO « Applications et principes de base de la spectrophotométrie ».
Quelle est la différence entre un spectrophotomètre à balayage et un spectrophotomètre à barrettes de diodes ?
Un spectrophotomètre UV VIS est un instrument conçu pour mesurer l'absorbance dans le domaine UV VIS selon la loi de Beer-Lambert. Il mesure l'intensité de la lumière qui traverse une solution échantillon dans une cuvette et la compare à l'intensité de la lumière avant qu'elle ne traverse l'échantillon.
Les principaux composants d'un spectrophotomètre UV VIS sont une source de lumière, un porte-échantillon, un dispositif dispersif pour séparer les différentes longueurs d'onde de la lumière et un détecteur approprié.
Spectrophotomètre à balayage
Les spectrophotomètres à balayage classiques réalisent des mesures consécutives de la transmission à chaque longueur d'onde définie. La lumière est séparée en plusieurs longueurs d'onde par un réseau de diffraction. Une cuvette contenant l'échantillon est placée entre le réseau de diffraction et le détecteur.
Spectrophotomètre à barrettes de diodes
Dans un spectrophotomètre à barrettes de diodes, l'échantillon est éclairé par un continuum, c'est-à-dire par toutes les composantes spectrales de la lumière en même temps, et absorbe différentes longueurs d'onde simultanément. La lumière transmise est ensuite diffractée par un réseau de réflexion. Cet instrument permet d'acquérir le spectre UV VIS plus rapidement qu'à l'aide d'un spectrophotomètre à balayage classique.
Par rapport à un spectrophotomètre à balayage, un spectrophotomètre à barrettes de diodes est dépourvu de parties mobiles.
Pour en savoir plus, téléchargez le livre blanc « Barrettes de diodes contre balayage ». Ce livre blanc compare les deux versions de spectrophotomètres UV VIS établies et évalue leurs performances, ainsi que leurs avantages.
Lorsque la mesure UV VIS joue un rôle essentiel, en particulier dans le contrôle de la qualité clinique, pharmaceutique et industrielle, il est crucial que l'instrument de spectrophotométrie fonctionne conformément à ses spécifications. Une vérification des performances doit donc être effectuée à intervalles réguliers. Les résultats d'étalonnage doivent également être enregistrés et conservés.
Téléchargez le livre blanc « Comment les laboratoires UV VIS doivent-ils étalonner leurs spectrophotomètres ? » pour en savoir plus sur l'importance de l'étalonnage par rapport aux révisions du chapitre 10 consacré à l'UV VIS de la Pharmacopée européenne et de l'USP42 NF37.
Les principaux paramètres à étalonner pour un spectrophotomètre UV VIS
Les principaux paramètres à étalonner pour un spectrophotomètre UV VIS sont présentés dans le tableau suivant.
Test de performances
Matériau de référence certifié (MRC)
Paramètre de test de l'instrument
Critère d'acceptation
USP 42 NF 37
Ph. Eur. 10
Précision de la longueur d'onde et
répétabilité
Ho(ClO4)3 : 4 % Ho2O3 dans HClO4 10 % v/v
Blanc : air
14 longueurs d'onde
(240 nm – 650 nm)
Xe : 2 longueurs d'onde (260,6 nm, 528,6 nm)
UV (200 – 400 nm) : ± 1 nm
VIS (400 – 780 nm) : ± 2 nm
(É-T) < 0,5 nm
UV (< 400 nm) :
± 1 nm
VIS (> 400 nm) :
± 3 nm
Photométrique
Précision et
répétabilité**
K2Cr2O7 dans HClO4 à 0,001 M
Blanc : HClO4 à 0,001 M
60 mg/L
0 A – 2 A,
235, 257, 313, 350 nm
Pour l'absorbance ≤ 1 A
Précision : ± 0,010 A
Répétabilité :
É-T ≤ 0,005 A
Pour l'absorbance > 1 A
Précision : ± 1 %
Répétabilité :
É-T ≤ 0,5 %
Précision : ± 0,010 A ou ± 1 %, la valeur la plus élevée étant retenue
Acide nicotinique dans
HCl à 0,1 M
Blanc : HCl à 0,1 M
12 mg/L
0,26 A – 1,6 A
213, 261 nm
Linéarité photométrique
K2Cr2O7 dans HClO4 à 0,001 M
Blanc : HClO4 à 0,001 M
6 – 200 mg/L, jusqu'à 3,0 A,
235, 257, 313, 350 nm
Tous les filtres mesurés remplissent les critères d'acceptation de précision photométrique
R2> 0,999
Acide nicotinique dans
Hcl à 0,1 M
Blanc : HCl à 0,1 M
6 – 60 mg/L, jusqu'à 2,5 A
213, 261 nm
Lumière diffuse selon la procédure A
(SFRM)
KCl/H2O à 1,2 % m/v ;
Longueur du trajet optique de 10 mm
Blanc : KCl/H2O à 1,2 % m/v, longueur du trajet optique de 5 mm
Amax à 198 nm
≥ 0,7 A
(NA)
Lumière diffuse selon la procédure B (SWM)
KCl/H2O à 1,2 % m/v ;
Longueur du trajet optique de 10 mm
Blanc : H2O, longueur du trajet optique de 10 mm
Amax à 198 nm
≥ 2,0 A
≥ 2,0 A
Résolution
Toluène à 0,02 % v/v dans du n-hexane
Blanc : n-hexane/
n-heptane (Ph. Eur. 10)
Amax, 269/Amin, 267
>1,3
Les niveaux sont spécifiés dans les normes correspondantes
** La Pharmacopée européenne ne spécifie pas de répétabilité photométrique (précision)
É-T - Écart-type
3. La science des couleurs
Les bases de la colorimétrie
Ce sont les couleurs qui rendent notre monde si intéressant. Lorsque nous voyons un objet, la lumière qui s'y reflète pénètre notre œil et est captée par plusieurs types de photorécepteurs dans la rétine. Selon la sensibilité des photorécepteurs, la perception d'une même couleur peut varier d'une personne à une autre.
Afin de définir une précision universelle d'une couleur spécifique, il faut lui attribuer une valeur numérique. En d'autres termes, l'équipement de mesure, qu'il s'agisse d'un spectrophotomètre ou d'un colorimètre, fournit des résultats sous forme de valeurs pour garantir la précision et la répétabilité colorimétriques.
Les spectrophotomètres quantifient les données relatives aux couleurs en collectant et en filtrant les longueurs d'onde transmises à travers un échantillon. Une équation mathématique est appliquée aux données spectrales pour cartographier la couleur sur une échelle de couleurs.
La CIE (Commission internationale de l'éclairage) a défini une échelle de couleurs à l'aide de trois paramètres : la teinte, la saturation et la luminosité.
La teinte est la couleur dominante d'un objet. La teinte s'obtient en combinant des couleurs primaires et secondaires.
La saturation indique si la couleur est vive ou terne.
La luminosité correspond à l'intensité lumineuse de la couleur (si elle est claire ou foncée).
Chaque système de couleur de la CIE utilise trois coordonnées pour situer une couleur sur une échelle. Les trois échelles de couleurs primaires sont Tristimulus CIE XYZ, CIE L*a*b* et CIE L*u*v*.
Par exemple, lorsqu'une couleur est exprimée selon le système CIE L*a*b* :
L* définit la luminosité ;
a* indique la valeur rouge/vert ;
b* indique la valeur jaune/bleu.
Selon l'échelle de couleurs CIE L*a*b*, les coordonnées du rouge de la rose représentée sont les suivantes :
L* = 29,00, a* = 52,48, b* = 22,23
Pour en savoir plus sur les bases de la colorimétrie, téléchargez le guide.
La couleur est un facteur essentiel pour reconnaître instantanément un objet.
La décision d'achat dépend souvent de la réussite de l'expérience visuelle globale. C'est pourquoi la couleur revêt une importance déterminante dans la définition de l'identité d'une marque et l'homogénéité des produits.
Différentes échelles de couleurs sont établies pour définir un produit de manière unique selon les normes du secteur. Parmi ces échelles figurent :
Échelle
Norme
Applications
Saybolt
ASTM D156, ASTM D6045
Pour déterminer si du carburant (kérosène, essence, diesel, naphta, etc.) est contaminé ou s'est dégradé pendant son stockage
APHA/Pt-Co/Hazen
ASTM D1209
L'indice de jaunissement est utilisé comme indicateur pour contrôler la pureté dans les secteurs de l'eau, l'industrie chimique, pétrolière et plastique
Gardner
ASTM D1544/D6166, DIN EN ISO 4630-2
Pour tester des produits, tels que des résines, des acides gras, des vernis et des huiles siccatives, qui se colorent en chauffant
CIELAB
DIN EN 11664-4, DIN 5033-3, 4630, ASTM Z 58.7.1 DIN 6174
Pour contrôler la qualité dans les segments des arômes et des parfums, ainsi que dans l'industrie agroalimentaire
Pour mesurer l'intensité des couleurs et la turbidité (trouble) en unités EBC de la bière, du malt, du caramel, etc.
USP/EUP
USP-24 Monograph 631, EP méthode 2.2.2
Pour contrôler la qualité des médicaments
Hess-Ives
DGK test method F 050.2
Pour tester les produits chimiques et les liquides tensioactifs (principalement dans le secteur des cosmétiques)
4. Analyse de microvolumes à l'aide d'un spectrophotomètre UV VIS
Comment réaliser une analyse de microvolumes par spectroscopie UV VIS ?
Un spectrophotomètre à microvolumes permet de mesurer des volumes d'échantillon de l'ordre de 1 µL. La concentration d'acides nucléiques dans un échantillon est généralement exprimée en nano- ou en microgrammes par millilitre.
Il n'est pas aisé de diluer des volumes aussi faibles et d'obtenir des résultats précis. Par conséquent, la microanalyse sans dilution joue un rôle clé pour l'analyse des acides nucléiques en aval.
Au cours de l'analyse d'acides nucléiques, l'échantillon à microvolume est pipeté dans le compartiment à la surface du socle. Le faisceau lumineux de la lampe est guidé par fibre optique jusqu'à la plateforme à microvolume. La longueur du trajet optique étant réduite à une distance de l'ordre du millimètre, des concentrations d'analyte plus élevées peuvent être analysées avec précision sans avoir à réaliser de dilution.
Un système à microvolume s'appuie sur la technologie de la fibre optique, ainsi que les propriétés inhérentes de l'échantillon (comme la tension superficielle) pour retenir l'échantillon sur la plateforme et déterminer l'absorbance en temps réel d'échantillons de très faibles volumes.
Forte de ces avantages, l'analyse de microvolumes constitue un choix idéal pour les analyses biomoléculaires.
Assistez au web-séminaire à la demande « Conseils et astuces permettant d'améliorer la précision des procédés d'analyse d'acides nucléiques à l'aide des bonnes pratiques UV VIS » pour obtenir des conseils et des astuces au sujet de l'analyse de microvolumes.
Contrôle qualité des acides nucléiques La quantification des acides nucléiques constitue une méthode préanalytique permettant d'obtenir des résultats précis et fiables dans le cadre de nombreux essais de biologie moléculaire, tels que le séquençage de nouvelle génération (NGS), la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), la PCR en temps réel (PCR quantitative ou PCRq), le clonage et la transfection.
Le contrôle qualitatif et quantitatif des acides nucléiques peut être réalisé en déterminant leur pureté et leur concentration.
Méthodes d'analyse de l'ADN La valeur A260 correspond à la corrélation de la concentration des nucléotides et la valeur A280 à celle des protéines résiduelles. La tyrosine et le tryptophane, deux acides aminés, absorbent à 280 nm et la phénylalanine à 260 nm. Ces valeurs permettent de calculer le rapport A260/A280 qui reflète la pureté de l'ADN en procédant à des mesures de l'absorbance directe. Un ADN de bonne qualité présente un rapport A260/A280 compris entre 1,7 et 2,0.
Essais de dosage des protéines Parmi les méthodes de dosage des protéines totales figurent la mesure de l'A280, la méthode à l'acide bicinchoninique (BCA), les méthodes de Bradford, de Lowry, de Pierce et d'autres essais récents. Les protéines contenues dans des solutions atteignent une valeur maximale à 280 nm du fait des acides aminés présentant des cycles aromatiques et une valeur minimale à 220 nm environ en raison de la présence de liaisons peptidiques.
La concentration se calcule à l'aide de la formule de Warburg :
concentration des protéines (mg/ml) = 1,55 X (lecture à A280) – 0,76 X (lecture à A260)
Pour en savoir plus sur l'analyse de l'ADN par spectroscopie UV VIS, téléchargez la brochure d'application « Rapport 260/280 : indicateur de contamination protéique ».
Quelles sont les erreurs courantes dans la mesure et l'étalonnage UV VIS ?
Il est possible d'atteindre un bon niveau d'exactitude et de fidélité dans les mesures UV VIS en prenant des précautions pour éviter des erreurs. Parmi les risques d'erreur types qu'il convient de prendre en compte lors de mesures UV VIS figurent :
les caractéristiques spectrales - la caractérisation spectrale est réalisée lors du processus d'étalonnage. Plusieurs facteurs peuvent provoquer des résultats erronés, tels que la précision de la longueur d'onde, la bande passante spectrale, la lumière diffuse et la linéarité ;
les caractéristiques photométriques - ces caractéristiques comprennent la sensibilité spectrale de la source lumineuse, la sensibilité en fonction de la température de la source lumineuse et du détecteur ;
les interactions optiques - les rayonnements de la source lumineuse peuvent interagir avec le matériau de la cuvette, altérant l'intensité d'absorbance de l'échantillon. Ces interactions optiques peuvent être évitées en sélectionnant une matière de cuvette appropriée ;
des facteurs divers - d'autres facteurs, comme la température, les variations de la tension du secteur, les vibrations, la contamination ou le chauffage de l'échantillon par le photomètre, peuvent également affecter les mesures.
GUVP™
Bien que toutes les erreurs ne puissent pas être évitées, elles peuvent être limitées pour obtenir de meilleurs résultats.
Téléchargez la brochure de bonnes pratiques UV VIS « Des résultats fiables en spectroscopie UV VIS ».
Tout ce que vous devez savoir à propos des cuvettes
Comment choisir la cuvette adaptée à chaque analyse ?
Le choix de la cuvette implique de sélectionner une matière et une taille adaptées à l'échantillon et à l'instrument utilisé.
La matière de la cuvette doit offrir une transmission suffisante à une longueur d'onde donnée. Une légère atténuation provoquée par les parois de la cuvette ne doit pas affecter le résultat de l'analyse. Les cuvettes en verre ne sont pas utilisées dans la région UV pour des analyses en dessous de 370 nm, car elles absorbent les rayons. Il est recommandé de les utiliser uniquement dans la région visible.
Le tableau suivant fournit les domaines de transmission nominale des cuvettes :
Matière
Domaine de transmission théorique (nm)
Quartz UV lointain
170–2 700
Verre optique
320–2 500
Quartz proche IR
220–3 800
Silice UV
220–2 500
Plastique UV
220–900
Cellule jetable en PS
340–750
Cellule jetable en PMMA
285–750
La taille des cuvettes a également un impact sur les capacités de mesure. La longueur nominale du trajet optique des rayons de la cuvette est de 10 mm. Selon l'échantillon, cette longueur peut varier de 1 mm à 100 mm.
Des cuvettes standard peuvent être utilisées pour la plupart des échantillons étudiés. Les cuvettes d'absorption et de fluorescence classiques présentent un socle externe de 12,5 mm x 12,5 mm, une hauteur de 45 mm et des dimensions internes de 10 mm x 10 mm.
Des cuvettes à long trajet optique (longueur de trajet optique de plus de 10 mm) sont utilisées lorsque l'échantillon est trop dilué ou que l'échantillon se vaporise ou subit une modification chimique au cours de l'analyse.
Des cuvettes à trajet optique court (longueur du trajet optique de moins de 10 mm) sont utilisées lorsque l'absorbance est élevée et qu'il est difficile de procéder à une dilution.
Comment manipuler les cuvettes correctement ?
Lors de la manipulation des cuvettes, il faut toujours saisir la cuvette par les côtés dépolis. Il convient d'éviter de toucher les surfaces optiques transparentes, car les empreintes digitales peuvent entraîner une hausse de l'absorbance et ainsi compromettre la précision.
Il vaut mieux éviter d'utiliser des pipettes Pasteur en verre pour remplir la cuve, car elles peuvent rayer la surface optique et provoquer des interférences. Il est recommandé d'utiliser des pipettes avec des cônes en plastique jetables.
La précision des résultats est intimement liée à la propreté des cuvettes, il s'agit donc d'un facteur très important à prendre en compte.
Il est recommandé de suivre les étapes suivantes pour un nettoyage en profondeur des cuvettes en quartz :
Plonger les cuvettes dans la solution de nettoyage.
Retirer la solution de nettoyage et rincer les cuvettes avec de l'eau déionisée.
Laver les cuvettes avec de l'éthanol ou de l'acétone, hormis dans le cadre d'analyses protéiques (voir le tableau ci-dessous).
Sécher les cuvettes en les essuyant à l'aide de papier absorbant non pelucheux, puis en les soumettant à un séchage à l'air libre ou au four.
Le tableau suivant fournit les domaines de transmission nominale des cuvettes.
Solutions aqueuses
Molécules organiques
Particules difficiles à éliminer
Protéines
Métaux lourds
Acides gras
Solutions de nettoyage
Parts égales en volume de HCl 3 M et d'éthanol
Laver avec 50 % d'acide nitrique
HNO3 concentré ou HCl 2 M
Parts égales en volume d'éthanol et de HCl 3 M
Incuber à température ambiante avec de la trypsine
(il n'est pas recommandé d'utiliser de l'éthanol et de l'acétone pour le nettoyage)
Parts égales en volume d'acide sulfurique 2 M et d'eau déionisée à 50 %
Eau régale
Parts égales en volume d'IPA et d'eau déionisée
Durée de trempage*
10 minutes
10 minutes
30 secondes
Toute la nuit
20 minutes
Essuyer
*La durée de trempage indiquée dans le tableau est une estimation très approximative ; cependant, il est uniquement recommandé de laisser tremper les cuvettes jusqu'à ce que les contaminants/souillures soient éliminés.
Les cuvettes en verre peuvent être nettoyées en les rinçant avec de l'acétone ou de l'éthanol, puis avec de l'eau. Le séchage à l'air libre est recommandé.
Les cuvettes en plastique peuvent être nettoyées avec de l'eau déionisée à plusieurs reprises. Il n'est pas recommandé de nettoyer les cuvettes en plastique avec des produits chimiques.
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Bonnes pratiques d'utilisation de spectrophotomètres à microvolumes
Préparation de l'échantillon La sensibilité de l'instrument peut être réduite en cas d'échantillons biologiques dilués. Afin d'augmenter la sensibilité face à ce type d'échantillons, il vaut mieux utiliser des concentrations plus élevées. Les mesures de microvolumes nécessitent en général 1 ou 2 µL d'échantillon. Il convient d'utiliser des pipettes étalonnées pour prélever l'échantillon. Il faut veiller à préparer un échantillon homogène en vue de l'analyse.
Nettoyage de la plateforme à microvolume Assurez-vous que la surface du socle et le miroir sont correctement nettoyés. Il vous suffit de les essuyer avec du papier absorbant non pelucheux et de l'eau déionisée. En cas de contact avec une solution tampon, un détergent ou un échantillon collant, nettoyez la surface à plusieurs reprises avant d'analyser l'échantillon suivant.
Installation de l'échantillon sur la plateforme Placez délicatement l'échantillon sur la surface pour éviter toute formation de bulles.
Respect des limites de détection Assurez-vous de connaître les limites de détection supérieure et inférieure de l'instrument et de les respecter.
Pratiques générales pour des mesures UV VIS précises
Faites attention lors de la préparation de l'échantillon et de son pipetage dans une cuvette ou une plateforme à microvolume. L'échantillon doit être homogène.
En cas de particules solides en suspension dans l'échantillon, la lumière peut se disperser. Dans ce cas, filtrez l'échantillon à l'aide d'un filtre à seringue.
Placez l'échantillon dans une cuvette en tenant compte de la dimension z du porte-échantillon. Vous aurez ainsi l'assurance que la lumière traverse bien l'échantillon. La dimension z est la distance qui sépare le fond de la cuvette et la hauteur à laquelle le faisceau lumineux traverse l'échantillon.
Nettoyez la cuvette à l'aide de papier absorbant non pelucheux avant chaque mesure. Utilisez un morceau de papier absorbant neuf à chaque fois.
Utilisez le même solvant/tampon que celui servant de blanc lors de la préparation de l'échantillon.
6. Quelles sont les applications de la spectroscopie UV VIS dans les différents secteurs ?
La spectroscopie UV VIS possède un large éventail d'applications dans de nombreux secteurs, dont les suivants :
Agroalimentaire
Colorimétrie (vin, par exemple), analyse du contenu (phosphate, SO2), frelatage, amertume, couleur, acides alpha, polyphénols totaux, azote aminé libre, anthocynogène, iode, teneur en fer et valeurs d'acide thiobarbiturique (bière, par exemple)
Pharmaceutique
La spectroscopie UV VIS est couramment utilisée dans le secteur pharmaceutique pour réaliser des analyses qualitatives (test d'identification), des analyses des ingrédients actifs, des études de dissolution, des vérifications des allégations, des profilages d'impuretés/pureté par absorption, des analyses de la composition en pourcentage, des analyses des couleurs ou de la stabilité des médicaments
Cosmétique
Évaluation de la photostabilité des agents destinés aux formulations, caractérisation des particules de l'agent bloquant les UV, évaluation de l'indice de couleur, détection de frelatage (secteur des parfums), études des propriétés optiques, quantification des colorants, antioxydants, etc.
Pétrochimie
Caractérisation du pétrole brut, calcul des fractions d'asphaltène, formulation des indices pour la teneur en aromatiques, qualité de la gravité du pétrole brut, teneur en sulfure, calcul du facteur de solubilité de Hildebrand (étendu aux bitumes, aux pétroles lourds et aux schistes bitumeux, ainsi qu'aux hydrocarbures produits par craquage catalytique, cokéfaction ou liquéfaction du charbon)
Chimie
Détermination des propriétés chimiques, évaluation finale de la qualité des produits finis, étude de la composition des polymères, qualification des eaux usées, détermination de la pureté et de l'efficacité de colorants, dégradation photocatalytique des polymères/colorants, résidus de pesticides dans le sol ou l'eau
Biotechnologie
Concentration et pureté de l'acide nucléique, protéines (A280, BCA, Biuret, Bradford Lowry, DO 600), mesures de cultures cellulaires microbiennes, dénaturation des protéines, études cinétiques (activité enzymatique), échantillons biologiques, comme le sang, le plasma, le sérum, etc.
METTLER TOLEDO propose un large éventail de méthodes d'application validées. Trouvez la méthode d'application qui répond le mieux à vos besoins grâce à notre moteur de recherche en ligne.
Quels sont les différents types de spectroscopie ?
Les différentes techniques de spectroscopie se distinguent principalement par le type de rayonnements qu'elles utilisent, l'interaction entre l'énergie et le matériau, ainsi que le type de matériaux et les applications auxquelles ils sont destinés. Les techniques de spectroscopie couramment utilisées pour les analyses chimiques sont la spectroscopie atomique, la spectroscopie ultraviolet-visible (spectroscopie UV VIS), la spectroscopie infrarouge, la spectroscopie Raman et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire.
Type de spectroscopie
Type de rayonnement
Interactions
Longueur d'onde
Spectroscopie à rayons ϒ
Rayons ϒ
Noyau atomique
< 0,1 nm
Spectroscopie de fluorescence aux rayons X
Rayons X
Électrons des couches internes
0,01 – 2,0 nm
Spectroscopie UV sous vide
Ultraviolet (UV)
Ionisation
2,0 – 200 nm
Spectroscopie UV VIS
UV VIS
Électrons de valence
200 – 800 nm
Spectroscopie infrarouge et Raman
Infrarouge
Vibrations moléculaires
0,8 – 300 mm
Spectroscopie micro-onde
Micro-ondes
Rotations moléculaires
1 mm à 30 cm
Spectroscopie par résonance paramagnétique électronique
Spin électronique
Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire
Ondes radio
Spin nucléaire
0,6 – 10 m
Quelles sont les différentes interactions moléculaires dans la région UV ?
L'absorption de la lumière UV entraîne des transitions électroniques de faibles niveaux d'énergie vers des niveaux plus élevés. Dans les molécules organiques, seuls certains groupes fonctionnels (chromophores) contenant des électrons de valence à faible énergie d'excitation absorbent le rayonnement ultraviolet. Les transitions/interactions moléculaires provoquées par l'absorption des UV sont les suivantes :
π - π* (transition pi à pi étoile) – orbitale liante à orbitale antiliante
n - π* (transition n à pi étoile) – orbitale non liante à orbitale antiliante
Ces transitions ont besoin d'un groupe non saturé dans la molécule pour générer les électrons π.
Les transitions σ (liantes) à σ* (antiliantes) nécessitent des niveaux d'énergie supérieurs et ne peuvent donc pas être détectés par spectroscopie UV VIS.
Quelle est l'incidence des groupes fonctionnels sur les spectres ?
Prenons un groupe fonctionnel contenant des atomes avec une ou plusieurs paires isolées d'électrons qui n'absorbent pas le rayonnement ultraviolet/visible. Lorsque ce groupe fonctionnel est relié à un chromophore, il altère l'intensité et la longueur d'onde d'absorption. Ce phénomène est baptisé un auxochrome, c'est-à-dire un groupe qui intensifie la couleur.
La présence d'un auxochrome provoque le décalage de la position d'un pic ou d'un signal vers une longueur d'onde plus grande, ce qui est désigné par le terme de décalage bathochromique ou de décalage rouge. Les groupes fonctionnels contribuant aux groupes bathochromiques sont des substituants, tels que les groupes méthyle, hydroxyle, alcoxyle, halogène et aminé.
Le décalage de la position d'un pic ou d'un signal vers une longueur d'onde plus courte entraîné par un auxochrome est appelé décalage hypsochromique ou décalage bleu. En fait, la combinaison du chromophore et de l'auxochrome se comporte comme un nouveau chromophore avec un maximum d'absorption différent (λmax). Par exemple, le benzène présente un λmax à 256 nm, contre un λmax à 280 nm pour l'aniline. De ce fait, le groupe NH2 agit comme un auxochrome et provoque le décalage de λmax vers une valeur plus élevée.
Quelle est la différence entre la bande passante spectrale et la résolution en spectroscopie UV VIS ?
La bande passante spectrale (BPS) d'un spectrophotomètre est liée à la largeur physique de la fente et à la dispersion optique du monochromateur. La résolution est la capacité d'un instrument à séparer la lumière en régions de longueurs d'onde distinctes et finies, ainsi qu'à distinguer chaque région finie. La bande passante spectrale est généralement utilisée pour les instruments à balayage et la résolution pour les instruments à barrettes de diodes.
Pour les besoins de quantification de la plupart des pharmacopées, une bande passante spectrale de moins de 2 nm suffit et le critère d'acceptation pour le rapport est de 1.3. La résolution spectrale peut être utilisée à des fins de comparaison avec la bande passante spectrale.
Le tableau indique la résolution des spectrophotomètres Excellence UV VIS de METTLER TOLEDO, qui est mesurée en utilisant du toluène dans de l'hexane, et la BPS équivalente.
Dimensions
Résolution spectrale
BPS équivalente (nm)
UV5
> 1,5
< 2,0
UV5Bio
> 1,5
< 2,0
UV5Nano
> 1,7
< 1,5
UV7
> 1,9
≤ 1,0
Quelles sont les différentes sources lumineuses utilisées dans un spectrophotomètre UV VIS ?
La meilleure source lumineuse est celle qui offre une bonne intensité pour un faible bruit sur toutes les longueurs d'ondes des ultraviolets et de la lumière visible, tout en garantissant une bonne stabilité sur de longues périodes. De nombreuses sources lumineuses sont couramment employées comme indiqué ci-dessous.
Source de lumière
Plage de longueurs d'onde
(nm)
Région
Durée de vie
Lampe à incandescence
350 - 2 500
VIS + IR
3 000 h
Lampe à arc au deutérium
190 - 400
UV
1 000 h
Lampe à hydrogène
190 - 400
UV
1 000 h
Lampe flash xénon
190 - 1 100
UV + VIS + NIR
5 500 h*
* Correspond à des flashs de 50 Hz en utilisation constante
Dans quelle mesure un réseau de diffraction est-il meilleur qu'un prisme ?
Les prismes et les réseaux de diffraction sont des éléments de dispersion classiques. Un prisme permet la dispersion grâce à la différence d'indice de réfraction du matériau en fonction de la longueur d'onde. Le réseau de diffraction, quant à lui, s'appuie sur la différence de sens de diffraction pour chaque longueur d'onde due aux interférences. Les prismes et les réseaux de diffraction peuvent tous deux décomposer les spectres lumineux en différentes couleurs en vue de l'analyse. Cependant, un réseau de diffraction est moins sensible à la couleur de la lumière et peut séparer les couleurs sur un angle plus large qu'un prisme. Le verre du prisme est transparent à la lumière visible, mais il absorbe et bloque la lumière dans la région infrarouge et ultraviolette du spectre. Un réseau de diffraction pourvu de quelques centaines de raies par centimètre peut dévier la lumière dans la partie centrale du spectre visible d'au moins 20 degrés. L'angle de déflexion d'un prisme en verre est généralement beaucoup plus petit.
Quels composés inorganiques peuvent être mesurés par spectroscopie UV VIS ?
Les molécules peuvent être analysées par spectroscopie UV VIS dès lors qu'elles possèdent un groupe fonctionnel ou une conjugaison ou qu'elles produisent un complexe coloré. Comme les composés inorganiques ne contiennent pas de groupe fonctionnel ni de conjugaison, la méthode courante utilisée pour les analyser consiste à les soumettre à une réaction avec un composé approprié. Cette réaction génère un complexe coloré dont l'absorbance peut être mesurée par un spectrophotomètre dans la région visible et corrélée à sa concentration réelle. Par exemple, le fer est généralement analysé par réaction avec de la 1,10-phénanthroline afin de produire un complexe de couleur rouge. L'absorbance du complexe est mesurée à 570 nm pour estimer la concentration de fer.
Qu'est-ce qui distingue les spectrophotomètres à simple et à double faisceau ?
La principale différence entre un spectrophotomètre à simple faisceau et son homologue à double faisceau est la suivante :
Spectrophotomètre à simple faisceau - Un seul faisceau de lumière traverse l'échantillon
Spectrophotomètre à double faisceau - Le faisceau de lumière est divisé en deux parties : la première traverse l'échantillon, tandis que la seconde traverse le matériau de référence
La division du faisceau peut être réalisée de deux manières :
de manière statique, à l'aide de miroirs partiellement transmetteurs ou un dispositif analogue ;
en atténuant les faisceaux à l'aide de dispositifs mécaniques et optiques mobiles.
Comment analyser un film polymère solide par UV VIS ?
L'analyse d'un échantillon solide est réalisée principalement en estimant son absorbance, sa transmission et sa réflectance. Parmi les paramètres courants déterminés pour les polymères solides figurent le pourcentage de transmission, la longueur d'onde de coupure et l'indice de jaunissement. L'échantillon est installé sur un support spécialement conçu pour accueillir des échantillons solides et les relevés sont réalisés de la même manière que pour les échantillons liquides. Un porte-échantillon solide permet de mesurer des échantillons solides, comme des films ou du verre.
La température a-t-elle une incidence sur l'analyse UV VIS ?
La température affecte les valeurs d'absorbance. Différents solvants subissent différentes interactions à différentes températures. Les paramètres de solution qui changent sous l'effet de la température sont les suivants :
Vitesse de réaction. La vitesse change en cas de hausse de la température, ce qui provoque une modification de l'activité de l'échantillon. Les réactions enzymatiques/biomoléculaires sont très sensibles à la température.
Solubilité d'un soluté. La solubilité est affectée par les variations de température. Une mauvaise solubilité peut entraîner une absorption imprécise.
Expansion ou contraction du solvant. Cela peut entraîner une modification de la concentration de la solution et avoir un effet sur l'absorbance, cette dernière étant en relation linéaire avec la concentration.
Effet Schlieren. Cet effet peut survenir en cas de variation de la température et provoquer une série de courants de convection pouvant modifier la valeur vraie d'absorbance.
Les paramètres de performances optiques, tels que le bruit photométrique, la précision/répétabilité des longueurs d'onde, la répétabilité photométrique et la lumière diffuse, ne sont pas influencés par la température sur une plage de 10 à 40 °C.
En revanche, les paramètres optiques, comme la résolution photométrique (rapport de toluène-hexane) et la précision photométrique (K2Cr2O7 dans du HClO4), présentent une dépendance à la température allant de 0,014 à -0,034/unité sur la plage comprise entre 10 et 40 °C.
Certains systèmes thermostatiques hautes performances, comme CuveT et CuvetteChanger, permettent de contrôler la température pour la spectrophotométrie UV VIS. En savoir plus ici.
Qu'est-ce que la lumière diffuse ?
La lumière diffuse correspond à la lumière atteignant le détecteur qui n'est pas émise par la source lumineuse de l'instrument et qui ne suit pas le trajet optique, ce qui provoque un écart à la longueur d'onde correspondante. Par conséquent, l'intensité lumineuse mesurée par le détecteur est supérieure à ce qu'elle devrait être. À l'inverse, cela signifie que l'absorbance mesurée est inférieure à la valeur vraie, car elle est réduite par l'action de la lumière diffuse. Cet effet est plus prononcé à des valeurs d'absorbance élevées (hautes concentrations d'échantillon).
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Pourquoi le compartiment d'échantillon est-il ouvert sur les spectrophotomètres UV VIS à barrettes de diodes ?
Le compartiment d'échantillon reste ouvert, car les instruments à barrettes de diodes utilisent une lentille inversée et procèdent à la détection simultanée de toutes les longueurs d'onde du spectre.
Lentille inversée : la lumière est diffractée après avoir traversé l'échantillon. De ce fait, seule une petite fraction de la lumière ambiante externe contribue au signal dans une région de longueurs d'onde donnée.
Détection simultanée : un détecteur à barrettes de diodes fournit 2 048 signaux d'intensité lumineuse en même temps, ce qui permet d'enregistrer l'ensemble du spectre en l'espace d'une seconde. Comme la mesure est très rapide, l'effet de la lumière ambiante s'en voit réduit de manière significative.
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