Cristallizzazione di proteine

L'espressione "cristallizzazione di proteine" indica sia l'azione che il metodo per la creazione di strutture reticolari ordinate di macromolecole complesse. Tipicamente, le proteine allo stato solido sono amorfe e tendono alla denaturazione; le proteine in strutture reticolari, invece, resistono alla denaturazione e sono caratterizzate da una maggiore stabilità. Le proteine possono cristallizzare se sono poste in ambienti adatti e ospitali. Data l'elevata complessità delle interazioni tra le variabili che influenzano il processo, la cristallizzazione di proteine è considerata un'arte, oltre che una scienza.

Una delle ragioni più comuni per la creazione di cristalli di proteine è la conduzione di indagini biologiche strutturali, in genere tramite cristallografia basata sulla diffrazione dei raggi-X. Attraverso lo studio della struttura tridimensionale delle proteine, i ricercatori possono visualizzare aree nel modello che consentono l'interazione con altre molecole (ad esempio, per comprendere meglio le modalità di interazione di enzimi, substrati e leganti). Inoltre, la cristallizzazione è un mezzo efficace per la creazione di proteine pure, prive di contaminazione da altre proteine o materiale biologico estraneo, e quindi offre un metodo alternativo alla cromatografia preparativa per la purificazione e la separazione. 

Le proteine rivestono un ruolo sempre più importante nei farmaci a scopo terapeutico. Tuttavia, la produzione di proteine sufficientemente stabili comporta il superamento di notevoli difficoltà, come la variabilità tra prodotti, la perdita di struttura, che può compromettere l'efficacia, e la formazione di sottoprodotti potenzialmente pericolosi. La cristallizzazione di proteine rappresenta un metodo per produrre formulazioni farmaceutiche solide, pure e stabili e numerosi farmaci per infusione e iniezione associati ai cristalli proteici. In passato, la cristallizzazione di proteine era soprattutto un'attività di laboratorio a supporto della cristallografia a raggi-X. Tuttavia, per via della crescita esponenziale dei farmaci a base proteica, il passaggio su scala industriale ha assunto una sempre maggiore rilevanza divenendo un'area su cui si è intensificata l'attenzione.

Nella sostanza, lo scale-up della cristallizzazione di proteine è analogo a quello della cristallizzazione di molecole di dimensioni ridotte, ed entrambi necessitano di ottimizzare i parametri critici di processo (CPP) a livello di laboratorio per ottenere gli attributi qualitativi essenziali (CQA) dei componenti farmaceutici prodotti su scala industriale. Una piattaforma completa per lo sviluppo e lo scale-up dei processi di cristallizzazione di proteine in genere comprende quanto segue:

• Caratterizzazione dei sistemi di particelle in situ
• Monitoraggio spettroscopico e caratterizzazione del polimorfismo
• Ottimizzazione delle strategie di processo e controllo tramite feedback attraverso moduli e sensori integrati

La cristallizzazione di proteine è associata ad applicazioni farmaceutiche di enorme rilievo: chimica medica tramite biologia strutturale, sviluppo, separazione e purificazione di farmaci a base proteica e, infine, formulazione e somministrazione dei farmaci.

• Chimica medica tramite biologia strutturale. I progressi nelle tecniche di cristallizzazione di proteine e il miglioramento della cristallografia a raggi-X hanno portato alla deduzione di decine di migliaia di strutture proteiche tridimensionali. Grazie alla determinazione della struttura di queste macromolecole complesse e alla visualizzazione dei siti di legame, si è resa possibile una comprensione estremamente dettagliata delle interazioni tra farmaco e recettore. Queste informazioni consentono di comprendere meglio a livello molecolare gli inibitori proteici, gli attivatori allosterici, i cofattori e persino i siti attivi (centri attivi) di catalizzatori ed enzimi, permettendo la produzione di farmaci migliori e caratterizzati da maggiore efficacia. Un esempio classico dell'importanza di comprendere la struttura proteina-inibitore mediante cristallografia è dato dai grandi progressi compiuti nello sviluppo degli inibitori delle proteasi dell'HIV.
• Sviluppo, scale-up, separazione e purificazione di farmaci a base proteica. In aggiunta alla produzione di cristalli di singole proteine per la cristallografia a raggi-X, l'industria farmaceutica ha intensificato gli sforzi volti allo sviluppo di farmaci a base proteica. L'obiettivo di queste applicazioni è lo sviluppo e lo scale-up di grandi quantità di cristalli proteici puri e stabili, caratterizzati da una corretta dimensione delle particelle e una distribuzione granulometrica accuratamente controllata. Con riferimento alla cromatografia preparativa, la cristallizzazione di proteine costituisce un possibile mezzo alternativo e conveniente per la separazione e la purificazione delle macromolecole e per l'isolamento delle molecole chirali. Gli strumenti per lo scale-up delle cristallizzazioni di proteine sono analoghi a quelli impiegati per lo scale-up delle reazioni chimiche, con la necessità di comprendere i parametri critici di processo (CPP) e il loro effetto sugli attributi qualitativi essenziali (CQA).
• Formulazione e somministrazione dei farmaci. I farmaci a base proteica si presentano come soluzioni somministrate per iniezione o infusione. A causa delle grandi quantità di proteine da somministrare, le soluzioni per infusione vengono diluite per evitare problemi di viscosità e aggregazione. Questo metodo è meno comodo per il paziente e per la struttura ospedaliera per via del tempo necessario a completare il trattamento, ma può favorire la compliance del paziente rispetto ad altre vie di somministrazione parenterale. L'uso di forme cristalline di proteine in sospensione è di grande interesse poiché queste formulazioni hanno meno problemi di viscosità e possono essere somministrate in concentrazioni superiori. Un altro punto fondamentale è che la dimensione dei cristalli deve essere attentamente controllata per assicurare che la sospensione passi facilmente attraverso l'ago per iniezione o infusione. Infine, è importante considerare anche che le dimensioni dei cristalli residui che non si dissolvono durante la ricostituzione non devono superare i valori critici che potrebbero causare effetti collaterali negativi a causa dell'accumulo nel sistema vascolare, in genere riducendo al minimo le quantità di particelle significative >15 µm. 

1. Scegliere il solvente appropriato. I principali aspetti da considerare comprendono la quantità di soluto che può essere disciolto (solubilità), la maneggevolezza del solvente (sicurezza) e in che modo il solvente influenzerà la stabilità e gli stati di energia libera del peptide o della proteina.
2. Raggiungere la supersaturazione. Il farmaco solubile a base di peptidi/proteine viene scaldato in un solvente o una soluzione tampone fino alla massima tolleranza consentita (in genere il limite è dato dalla denaturazione). La soluzione diventa supersatura.
3. Cristallizzare il prodotto controllando i parametri critici di processo (CPP). La solubilità è ridotta mediante raffreddamento, aggiunta di antisolvente, evaporazione o reazione. Riducendo la solubilità si raggiunge il punto in cui i cristalli iniziano a nuclearsi e quindi a crescere. Nei prodotti molto puri, la crescita dei cristalli non dovrebbe trovare ostacoli, sebbene si possano formare strutture alternative o non cristalline a causa di strutture supersecondarie con elevata energia libera; per prevenire questi fenomeni è necessario controllare in modo accurato i parametri critici di processo.
4. Lasciare che il sistema raggiunga l'equilibrio. In questo modo si ottimizza il rendimento del prodotto farmaceutico solido.
5. Filtrare ed essiccare il prodotto purificato.

Esistono diversi metodi per la produzione di cristalli proteici; tra i più diffusi figurano la diffusione in fase vapore e la cristallizzazione in microbatch. Il primo metodo presenta due varianti, descritte come hanging drop ("goccia pendente") e sitting drop ("goccia appoggiata"), il cui funzionamento è essenzialmente lo stesso. In un sistema sigillato, una goccia di soluzione che contiene la proteina, la soluzione tampone e il precipitante si equilibra con un reservoir che contiene concentrazioni maggiori di soluto rispetto alle gocce, ma senza la proteina. L'acqua della goccia contenente la proteina si vaporizza ed è attratta dal reservoir più concentrato. All'aumentare della concentrazione di soluti nella goccia, la proteina comincia a cristallizzare. Nel metodo della cristallizzazione in microbatch, le proteine e gli altri reagenti vengono introdotti e contenuti sotto un sottile strato di olio minerale che elimina la diffusione dell'acqua. Il microbatch è essenzialmente un piccolo reattore che contiene tutti gli ingredienti, in concentrazioni corrette e stabili, necessari a consentire la cristallizzazione.

Alla corretta definizione di reagenti, parametri e condizioni si giunge spesso in modo empirico; per questo motivo, il modo più agevole per assicurare un esito positivo nella cristallizzazione di proteine è applicare un'ampia gamma di condizioni sperimentali derivanti da esperienze precedenti. Il modo più semplice per farlo è usare gli appositi kit di screening disponibili sul mercato, che contengono soluzioni preconfezionate con soluzioni tampone, precipitanti e altre sostanze in piastre multipozzetto. Questi kit vengono utilizzati per la produzione di cristalli con il metodo della goccia pendente nella diffusione in fase vapore. Quando è necessario uno screening su larga scala, è possibile utilizzare sistemi ad alto rendimento per automatizzare la cristallizzazione in microbatch, consentendo di risparmiare tempo e fatica e, al contempo, ridurre al minimo la quantità necessaria di proteina purificata. Nelle cristallizzazioni di proteine su larga scala richieste in ambito farmaceutico o industriale, le informazioni ottenute negli esperimenti di screening formano la base per applicazioni in sistemi di reattori automatici di scala maggiore con PAT in situ in tempo reale. 

Nello sviluppo dei processi e nella produzione, uno dei più importanti passaggi iniziali per la corretta cristallizzazione di proteine è assicurare un'adeguata disponibilità di proteine ad alta purezza e ben caratterizzate. Oltre a essere pura (ossia priva di contaminanti, quali impurezze da substrati di fermentazione), la proteina deve essere anche omogenea e stabile (o stabilizzata) in soluzione con:

• Aggregazione minima (figura A)
• Struttura secondaria, terziaria e quaternaria corretta (figura B)
• Eventuali modifiche per coniugazione o ricombinazione (figura C)

Inoltre, tutti i reagenti e i solventi utilizzati nel processo di cristallizzazione di proteine devono essere privi di contaminanti, che potrebbero produrre effetti significativi sulla nucleazione.

Come per le molecole di dimensioni ridotte, la cristallizzazione di proteine avviene in soluzioni supersature. Il controllo della temperatura è un mezzo primario per raggiungere la supersaturazione per le molecole di piccole dimensioni che formano robuste strutture reticolari. Lo stesso vale per le proteine, anche se è ammissibile un intervallo di temperatura ridotto. Infatti, tipicamente i cristalli proteici presentano solvente come parte della struttura cristallina, sono spesso sensibili alla temperatura e sono soggetti a fenomeni di denaturazione e aggregazione.

Le molecole di dimensioni ridotte hanno gradi molto inferiori di libertà stereoscopica e, di conseguenza, cristallizzano molto più facilmente. Le molecole di peptidi di grandi dimensioni presentano un maggior numero di interazioni acide, basiche, polari e non polari e forze repulsive che ostacolano una cristallizzazione ordinata, un fenomeno ancor più evidente nelle proteine di dimensioni maggiori. Moltissimi peptidi compatibili con la cristallizzazione, inoltre, contengono una quantità significativa di legami disolfurici, che sono fondamentali per immobilizzare le strutture supersecondarie. L'entità del disordine intramolecolare o della possibile variazione di struttura è un attributo importante per determinare se un peptide o una proteina possono cristallizzare anziché precipitare. Anche se la molecola presenta attributi favorevoli alla cristallizzazione, sono molti i parametri di processo che possono influenzare la sostenibilità commerciale del processo e devono quindi essere caratterizzati.

Oltre alla temperatura, la cristallizzazione di proteine tramite supersaturazione è ostacolata o favorita da numerosi altri fattori, come la regolazione del pH e la forza ionica delle soluzioni, l'aggiunta di sali e precipitanti come PEG per contribuire a ridurre la solubilità delle proteine, i tipi di leganti presenti e così via. L'essenziale è supersaturare la soluzione all'interno di un ambiente che non disturbi il normale carattere della proteina. Ciò evidenzia l'importanza di individuare una serie di variabili e condizioni che diano luogo a cristalli con la corretta morfologia e purezza e tassi di crescita accettabili.

La cristallizzazione di proteine procede attraverso una serie di meccanismi interdipendenti:

1. Nucleazione
2. Crescita
3. Formazione di oli nella cristallizzazione
4. Agglomerazione
5. Rottura
6. Germinazione
7. Polimorfismo chimico

Questi meccanismi, spesso non rivelati dagli scienziati, svolgono un ruolo fondamentale che influisce sugli esiti del processo di cristallizzazione.

Lo sviluppo e lo scale-up della cristallizzazione per la produzione di farmaci a base proteica richiedono una profonda comprensione delle variabili e delle condizioni che influenzano il processo stesso di cristallizzazione. Come in altri tipi di cristallizzazione, è necessario un attento controllo per ottenere i valori desiderati quanto a forma, dimensioni e distribuzione granulometrica delle particelle e assicurare la qualità uniforme del prodotto. L'efficacia terapeutica è influenzata direttamente da qualsiasi variazione negli attributi qualitativi essenziali delle sospensioni di cristalli proteici. Poiché i cristalli proteici sono molto sensibili all'ambiente di crescita e possono danneggiarsi facilmente a causa di temperature eccessive, perdita di solvente o altri fattori esterni, o persino nel processo di campionamento, è consigliabile misurare i parametri critici di processo e la qualità del prodotto in situ, ossia senza rimuovere i cristalli dall'ambiente della soluzione.

• I reattori chimici automatici EasyMax e Optimax consentono di effettuare in modo accurato il controllo, la regolazione e la registrazione di parametri quali temperatura, pH, conducibilità, velocità di agitazione e dosaggio di soluzioni tampone ed eccipienti, che sono di importanza fondamentale per la riuscita dei processi di sviluppo e scale-up delle cristallizzazioni di proteine
• Di grande utilità sono anche le tecnologie analitiche in situ, che facilitano il monitoraggio, la risoluzione dei problemi e la correzione delle deviazioni di processo
  • La spettroscopia Raman in situ e la spettroscopia FTIR monitorano le concentrazioni di reagenti e la crescita della struttura cristallina e, inoltre, misurano la concentrazione delle soluzioni supersature
  • La tecnologia ParticleTrack (con FBRM) monitora in tempo reale i cambiamenti nelle dimensioni e nella distribuzione granulometrica dei cristalli al procedere dei segmenti chiave del processo di cristallizzazione
  • EasyViewer consente la visualizzazione e l'analisi delle immagini della cristallizzazione durante il processo

L'uso congiunto di reattori automatici di laboratorio e analizzatori in situ in tempo reale consente di identificare l'impatto dei parametri di processo sui meccanismi di cristallizzazione, quali aggregazione, crescita, agglomerazione, rottura e modifica della forma. Grazie al controllo accurato del processo di cristallizzazione associato al monitoraggio continuo in situ della formazione dei cristalli, è possibile basare l'ottimizzazione e lo scale-up su informazioni e dati certi.

Il reattore automatico da laboratorio EasyMax è una stazione completa per l'ottimizzazione dei parametri per supportare lo sviluppo, la progettazione dello scale-up e l'esecuzione nella cristallizzazione di proteine. Questo sistema completamente automatico offre un controllo accurato sui parametri di processo.

• Gestione dei parametri critici di processo, come velocità di dosaggio, temperatura, agitazione, pH e conducibilità
• Facilità di integrazione con gli strumenti per le analisi in situ della cristallizzazione, tra cui ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM) e EasyViewer (analisi delle immagini in situ)
• iC Software consente di eseguire e controllare in modo automatico tutti gli esperimenti e gli strumenti periferici assicurando inoltre la completa acquisizione e tracciabilità dei dati

ReactIR sfrutta la spettroscopia infrarossa per determinare la fase della soluzione negli studi di cristallizzazione. Le misure di ReactIR non sono influenzate da solidi in sospensione, bolle o altre masse di particolato.

• Monitoraggio dei singoli soluti in situ e in tempo reale
• Determinazione delle concentrazioni della soluzione a supporto degli studi di supersaturazione
• Fornitura di dati analitici utilizzabili per processi decisionali e di controllo in tempo reale

ReactRaman utilizza la spettroscopia Raman per fornire l'analisi molecolare delle particelle in soluzione.

• Monitoraggio di crescita, struttura e morfologia dei cristalli con metodi non distruttivi, in situ e in tempo reale
• Determinazione degli effetti dei parametri e ottimizzazione delle condizioni e delle variabili della cristallizzazione per raggiungere gli obiettivi di qualità

ParticleTrack con tecnologia FBRM (Focused Beam Reflectance Measurement) è uno strumento ottico basato su sonda che viene inserito direttamente nel recipiente per monitorare la variazione delle dimensioni e del numero delle particelle in tempo reale. ParticleTrack utilizza misure della distribuzione della lunghezza di corda per ottenere la distribuzione granulometrica dei cristalli (CSD).

• Monitoraggio continuo dei cristalli proteici al variare delle condizioni sperimentali
• Monitoraggio in tempo reale della crescita continua o dei lotti durante la cristallizzazione senza necessità di estrarre campioni
• Caratterizzazione delle condizioni che influenzano nucleazione, aggregazione, polimorfismo e altri attributi di sistema

EasyViewer è uno strumento basato su sonda che viene inserito direttamente nel recipiente per acquisire immagini dei sistemi di particelle. EasyViewer esegue l'analisi delle immagini del processo in linea risolte nel tempo e ricava informazioni su numero delle particelle, distribuzione granulometrica e morfologia, che consentono di determinare di volta in volta i trend associati alle popolazioni.

• Monitoraggio continuo dei cristalli proteici al variare delle condizioni sperimentali
• Monitoraggio in tempo reale della crescita continua o dei lotti durante la cristallizzazione senza necessità di estrarre campioni
• Visualizzazione in tempo reale dei parametri di cristallizzazione che influenzano nucleazione, aggregazione, polimorfismo e altri attributi di sistema

Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Real-Time Monitoring of Biopharmaceutical Crystallization: Chord Length Distribution to Crystal Size Distribution for Lysozyme, rHu Insulin, and Vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619.

Nell'articolo gli autori riferiscono l'esito positivo dello sviluppo di un approccio efficiente al monitoraggio in tempo reale delle cristallizzazioni nella produzione di biofarmaci. La procedura prevede l'impiego di ParticleTrack per misurare la distribuzione di lunghezza delle corde (CLD) di una serie di molecole biofarmaceutiche in condizioni sia statiche che dinamiche e, quindi, l'applicazione di modelli matematici per convertire il valore di CLD in distribuzione granulometrica dei cristalli (CSD). Le biomolecole oggetto dello studio presentano forme cristalline diverse, dipendenti dalle condizioni sperimentali della cristallizzazione. Il lisozima produce cristalli tetragonali e aghiformi, l'insulina rHu forma cristalli romboedrici e la vitamina B12 forma cristalli poliedrici.

Gli autori hanno sviluppato modelli per determinare la CSD dei cristalli tetragonali, romboedrici e poliedrici, caratterizzati da un rapporto basso tra le proporzioni, e dei cristalli aghiformi, con proporzioni molto allungate. Per determinare la distribuzione granulometrica dei cristalli, hanno utilizzato tre diversi modelli:

• Per i cristalli con rapporto basso tra le proporzioni si è dimostrato efficace un modello sviluppato da un altro team di ricerca, basato sull'assunto che i cristalli potessero essere rappresentati come sfere (diametro sferico equivalente)
• Per i cristalli con proporzioni allungate, gli autori hanno sviluppato un modello basato sulla larghezza
• Infine, è stato sviluppato un modello basato sulla lunghezza e che richiede che vengano specificate le proporzioni

I risultati dei modelli sviluppati per calcolare la CSD ricavata dalle misure con FBRM sono stati quindi confrontati con le misure di CSD ottenute mediante l'analisi delle immagini.

Il monitoraggio di impasti cristallini opachi presenta difficoltà, specialmente quando le specifiche di produzione richiedono una distribuzione granulometrica delle particelle (PSD) ristretta. Nelle formulazioni di cristalli proteici iniettabili, il valore di PSD può influenzare notevolmente la viscosità; inoltre, può costituire un segnale tempestivo di aggregazione o altri fenomeni di degradazione che possono compromettere la formulazione.Il monitoraggio in situ è stato impiegato in uno studio di cristallizzazione per lo scale-up di lotti allo scopo di caratterizzare la formazione e la crescita di cristalli di somatotropina umana (hGH). L'analisi in tempo reale ha individuato una deviazione del normale profilo di PSD dovuta a differenze di miscelazione nei diversi recipienti. Il risultato è stato confermato da una successiva analisi delle immagini offline.

• Orehek, J., Teslić, D., & Likozar, B. (2020). Continuous Crystallization Processes in Pharmaceutical Manufacturing: A Review. Organic Process Research & Development, 25(1), 16–42. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.0c00398
• Unno, J., & Hirasawa, I. (2020). Parameter Estimation of the Stochastic Primary Nucleation Kinetics by Stochastic Integrals Using Focused-Beam Reflectance Measurements. Crystals, 10(5), 380. https://doi.org/10.3390/cryst10050380
• Pandit, A., Katkar, V., Ranade, V., & Bhambure, R. (2018). Real-Time Monitoring of Biopharmaceutical Crystallization: Chord Length Distribution to Crystal Size Distribution for Lysozyme, rHu Insulin, and Vitamin B12. Industrial & Engineering Chemistry Research, 58(18), 7607–7619. https://doi.org/10.1021/acs.iecr.8b04613
• Wang, Z., Liu, T., Lu, C., & Dang, L. (2018). Manipulating crystallization in lysozyme and supramolecular self-arrangement in solution using ionic liquids. CrystEngComm, 20(16), 2284–2291. https://doi.org/10.1039/c8ce00107c
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Christofides, P. D., & Orkoulas, G. (2014). Modeling and control of crystal shape in continuous protein crystallization. Chemical Engineering Science, 107, 47–57. https://doi.org/10.1016/j.ces.2013.12.005
• Kwon, J. S. I., Nayhouse, M., Orkoulas, G., & Christofides, P. D. (2014). Enhancing the Crystal Production Rate and Reducing Polydispersity in Continuous Protein Crystallization. Industrial & Engineering Chemistry Research, 53(40), 15538–15548. https://doi.org/10.1021/ie5008163
• Basu, S. K., Govardhan, C. P., Jung, C. W., & Margolin, A. L. (2004). Protein crystals for the delivery of biopharmaceuticals. Expert Opinion on Biological Therapy, 4(3), 301–317. https://doi.org/10.1517/14712598.4.3.301