Good Pipetting Practice: betere resultaten door training en ondersteuning

De meeste life science-toepassingen omvatten kritieke vloeistofverwerkingsstappen waarbij het gepipetteerde volume het resultaat rechtstreeks beïnvloedt. Als pipetteren niet consistent en nauwkeurig is, kunnen tijd, geld en materiaal verloren gaan. Nauwkeurig pipetteren vormt de basis van reproduceerbaar werk, dat essentieel is voor het genereren van zinvolle gegevens.

De eerste stap om de pipetteernauwkeurigheid te verbeteren, is het kiezen van de juiste pipet en het juiste volumebereik. Kies voor de grootte de pipet met het laagste volume die geschikt is voor het volume dat u pipetteert. Als u bijvoorbeeld 2 μl pipetteert en een pipet van 5 μl en een pipet van 20 μl hebt, krijgt u een betere nauwkeurigheid met de pipet van 5 μl. 

Bekijk deze white paper over pipetselectie om te begrijpen welke pipet het beste werkt voor de vloeistof en andere factoren die uniek zijn voor uw situatie: De juiste pipet selecteren

Als u eenmaal het juiste instrument hebt, brengt u uw pipetteertechniek in de praktijk. Stel een routinematig testschema op om het vertrouwen in uw resultaten te maximaliseren en, zoals bij elk precisie-instrument, zorg ervoor dat u een regelmatig, deskundig onderhouds- en kalibratieregime instelt.

De eenvoudigste manier om snel de nauwkeurigheid van een pipet te testen, is de SmartCheck van RAININ. Meer informatie vindt u op mt.com/SmartCheck 

Het kiezen van de juiste pipet houdt in dat u uw vereisten evalueert. Ten eerste, wat voor soort monsters pipetteert u? Zijn ze waterig? Of zijn ze viskeus, vluchtig, schuimend, bijtend of explosiegevaarlijk? Voor waterige en bijna waterige vloeistoffen zijn de meest voorkomende air-displacement pipetten (ook wel "air cushion pipetten" genoemd) een goede keuze. Voor viskeuze, vluchtige en andere ongebruikelijke vloeistofsoorten is een positive displacement pipet een betere keuze voor zowel nauwkeurigheid als veiligheid. 

Welk volume gaat u pipetteren? Hoeveel monsters moet u van het ene vat naar het andere overbrengen? Lees deze whitepaper over pipetselectie om te begrijpen welke pipet het beste werkt, afhankelijk van de vloeistof en andere factoren die uniek zijn voor uw situatie.

Voor het pipetteren van de kleinst mogelijke volumes zijn gespecialiseerde instrumenten en technieken nodig. Een repeteerpipet kan de beste keuze zijn voor het herhaaldelijk doseren van volumes tot 100 nL. Een andere pipet kan ook voor slechts een paar doseringen werken. Zorg ervoor dat u een pipet gebruikt die geschikt is voor het volume dat u wilt pipetten. 

Bij zeer lage volumes heeft de pipetteertechniek een verhoudingsgewijs grotere impact op de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid. Onderdompelingsdiepte, pipetteerhoek en aspiratiesnelheid zijn belangrijk om te controleren. De poster 'Pipetteertechnieken ' van RAININ kan hierbij helpen.

De NanoRep van RAININ doseert aliquots tot 100 nL. Lees hier meer: mt.com/NanoRep

De belangrijkste factor bij nauwkeurig, reproduceerbaar meerkanaals pipetteren is de integriteit van de afdichting voor elk kanaal van de pipet. Dat betekent dat elke pipetpunt perfect op elke schacht past zonder het verlies van lucht. Verschillende fabrikanten bereiken dit op verschillende manieren, met verschillende ergonomische gemaks- en afdichtingsconsistenties. De pipetpunten van het LTS LiteTouch-systeem van RAININ vereisen de minste kracht om te laden en af te werpen en ze sluiten elke keer weer consistent af.

Klik hier om het uitgebreide assortiment multichannelpipetten van RAININ te bekijken.

Houd bij het opzuigen een pipet zo verticaal mogelijk en vermijd elke hoek van meer dan 20° ten opzichte van de Y-as. Als u bij het doseren de wand van het vat aanraakt om alle vloeistof volledig uit de punt te trekken, is het OK om de hoek van 20° te overschrijden.

Voorwaarts pipetteren is de standaard pipetteertechniek en de beste keuze voor waterige monsters. Voor viskeuze en vluchtige monsters levert omgekeerd pipetteren een betere nauwkeurigheid.

Om voorwaarts te pipetteren, duwt u de zuiger naar beneden tot aan de eerste stop terwijl u de pipet buiten de vloeistof houdt. Dompel vervolgens de punt 2-10 mm diep onder in de vloeistof waarmee u werkt - niet dieper. Laat de zuiger langzaam volledig los om het volledige vloeistofvolume op te zuigen. Om in uw doelvat te doseren, beweegt u de pipet in het vat en drukt u de zuiger vervolgens met een gelijkmatige snelheid door de eerste stop helemaal tot aan de tweede stop - tot aan de plunjer. Terwijl de zuiger volledig is ingedrukt, sleept u de punt van de pipet lichtjes langs de wand van het vat omhoog om te 'touchen'. Dit helpt om het volledige vloeistofvolume volledig te doseren. Laat de zuiger los, werp de pipetpunt uit, plaats een nieuwe pipetpunt en herhaal.

Om achterwaarts te pipetteren, duwt u de zuiger helemaal naar beneden door de eerste stop naar de tweede stop - tot aan de zuiger. Dompel vervolgens de punt onder in vloeistof en laat de zuiger langzaam en gelijkmatig los om op te zuigen. Ga naar het ontvangende vat en druk de plunjer ALLEEN TOT AAN DE EERSTE STOP om het juiste volume af te geven. Er blijft een klein restvolume achter in de pipetpunt. Beweeg de pipet over een ander vat en druk de zuiger helemaal naar beneden tot aan de tweede stop, ook wel de "blowout"-stop genoemd, om eventuele resterende vloeistof te laten ontsnappen. 

Laat de zuiger los, werp de pipetpunt af, plaats een nieuwe pipetpunt en herhaal.

Een air displacement pipet kan worden gebruikt om licht viskeuze vloeistoffen, waaronder bloed, te pipetteren. Om maximale nauwkeurigheid te bereiken, gebruikt u de hierboven beschreven omgekeerde pipetteertechniek. Voor meer viskeuze vloeistoffen, zoals 85% glycerol of Triton X-100, biedt een positive displacement pipet de beste nauwkeurigheid en consistentie.

Licht vluchtige vloeistoffen, zoals ethanol, kunnen worden gepipetteerd met een air displacement pipet met behulp van de bovengenoemde omgekeerde pipetteertechniek. Positive displacement pipetten zijn echter een betere keuze voor vluchtige vloeistoffen. 

Als u een air displacement pipet gebruikt, spoel dan de pipetpunt minstens vijf keer voor (opzuigen en doseren) voordat u uw volume pipetteert. Hierdoor wordt de lucht in de pipet in evenwicht gebracht, waardoor de verdampingssnelheid van de vloeistof wordt vertraagd. Snelle verdamping van vluchtige vloeistoffen zet de lucht in een pipet uit en perst vloeistof uit de pipetpunt zonder dat er druk op de plunjer wordt uitgeoefend, wat de nauwkeurige volumeafgifte vermindert.

Vluchtige vloeistoffen, zoals acetonitril, kunnen over het algemeen beter worden behandeld met een positive displacement pipet.

Ja, pipetteren met air-displacement pipetten kan aerosolen veroorzaken. Aerosolen kunnen in het inwendige van de pipet opstijgen en de binnenwanden en zuiger verontreinigen. Aerosolisatie treedt gemakkelijker op wanneer de zuiger te snel wordt losgelaten tijdens het opzuigen en kan ook in de tegenovergestelde richting buiten de pipet optreden bij een te snelle dosering. 

Om aërosolen tot een minimum te beperken, moet u langzaam en gelijkmatig opzuigen en doseren. Gebruik gefilterde pipetpunten. 

Positive displacement pipetten maken gebruik van syringe pipetpunten die aerosolisatie voorkomen. Een positive displacement pipet is de beste keuze voor het pipetteren van gevaarlijke vloeistoffen en vloeistoffen met een verhoogde viscositeit of vluchtigheid.

Zeer koude of hete vloeistoffen veranderen de luchtdruk in air-displacement pipetten, wat leidt tot onnauwkeurig pipetteren. 

Positive displacement pipetten, met syringe pipetpunten die geen luchtzak hebben tussen vloeistof en zuiger, worden niet beïnvloed door verschillende temperaturen van vloeistoffen. Positive displacement pipetten leveren nauwkeurige resultaten met vloeistoffen die niet op kamertemperatuur zijn.

Als u een zeer hete of koude vloeistof moet pipetteren met een air-displacement pipet, spoel de pipetpunt dan niet voor. Dit is meestal de beste methode voor de hoogste nauwkeurigheid. Zuig in plaats daarvan snel op en doseer snel om het effect van de temperatuur van de vloeistof op de binnenste luchtspleet van de pipet te minimaliseren.

Om luchtbellen en schuimvorming tijdens het pipetteren te voorkomen, mag u de pipetpunt niet verder dan 10 mm in het vloeistofreservoir onderdompelen en langzaam opzuigen.

Omgekeerd pipetteren biedt extra bescherming omdat u voor het aanzuigen de plunjer volledig indrukt tot aan de 2e aanslag, zodat er geen kans is dat er lucht in het vloeistofmonster wordt geïnjecteerd. Ga voor meer informatie over omgekeerd pipetteren naar deze pagina. 

Een positive displacement pipet veroorzaakt geen luchtbellen of schuim bij interactie met vloeistof, omdat de syringe pipetpunt geen lucht biedt waarmee de vloeistof kan interageren.

Ontsmet een pipet door deze af te vegen met een natte doek en een reinigingsmiddel, zoals isopropanol of een 10% bleekoplossing. Vermijd het doorzichtige plastic venster van de micrometer.

Autoclaveren kan een andere optie zijn, maar controleer de instrumentspecificaties van uw pipet. Als het autoclaveerbaar is, is dan het hele instrument geautoclaveerd of alleen het vloeibare uiteinde?  Vaak kan alleen het vloeibare uiteinde worden geautoclaveerd.

Voor meer informatie over het reinigen van een pipet, download de poster Een pipet reinigen .

Kalibratie is de gecontroleerde en gedocumenteerde meting van het systematische foutenpercentage (nauwkeurigheid) en het willekeurige foutenpercentage (precisie) van een pipet. In veel laboratoriumomgevingen moeten de prestaties van pipetten regelmatig worden getest en wettelijk worden gedocumenteerd onder specifieke omstandigheden die zijn gecertificeerd door een geaccrediteerde instantie. 

ISO-gecertificeerde leveranciers kalibreren pipetten in een gecontroleerde omgeving. De resultaten worden veilig gedocumenteerd op een kalibratiecertificaat, wat bijdraagt aan een auditklare prestatiegeschiedenis voor elk instrument. Wanneer aanpassingen nodig zijn, bieden ISO-gecertificeerde kalibratielaboratoria deskundige service met door de fabrikant aanbevolen onderdelen en smeermiddelen. 

Rainin en METTLER TOLEDO zijn 's werelds grootste pipetserviceorganisatie met een snelle doorlooptijd van mail-in en on-site serviceopties. Servicelabs zijn ISO 17025-gecertificeerd en de procedures volgen de update van 2022 naar ISO 8655. 

De nauwkeurigheid van de pipet, of waarheidsgetrouwheid, zoals het nu wordt genoemd, is het verschil tussen het gemiddelde volume van alle metingen (4-10 metingen) en het ingestelde volume. 

Precisie is de standaarddeviatie van alle uitgevoerde metingen. Hoe ver liggen de andere uit elkaar?

De onzekerheid van een pipet is de kwantitatieve term voor de algehele nauwkeurigheid. Het is een combinatie van juistheid (een maat voor systematische fouten) en precisie (een maat voor willekeurige fouten). 

De vergelijking voor onzekerheid is: 

Onzekerheid = systematische fout + willekeurige fout * k. k (dekkingsfactor of Z-score) is afhankelijk van het aantal metingen. k=3,31 voor vier metingen en 2 voor tien metingen.

Bewaar pipetten verticaal, hangend aan een plank of pipetstandaard. Houd pipetten schoon en vrij van verontreinigingen. Houd de pipetpuntrekken gesloten.