Good Pipetter Practice: betere resultaten door training en ondersteuning

De meeste life science-toepassingen omvatten kritieke stappen voor het hanteren van vloeistoffen waarbij het pipettevolume rechtstreeks van invloed is op het resultaat. Als pipetteren niet consistent en nauwkeurig is, kunnen tijd, geld en materiaal verloren gaan. Nauwkeurig pipetteren vormt de basis van reproduceerbaar werk, dat essentieel is voor het genereren van zinvolle gegevens.

De eerste stap om de pipetteernauwkeurigheid te verbeteren, is het kiezen van het juiste type pipet en het juiste volumebereik. Kies voor de grootte de pipet met het laagste volume die geschikt is voor het volume dat u pipettert. Als u bijvoorbeeld 2 μl pipettert en een pipet van 5 μl en een pipet van 20 μl hebt, krijgt u een betere nauwkeurigheid met de 5 μl. 

Bekijk deze white paper over pipetselectie om te begrijpen welke pipet het beste werkt voor de vloeistof en andere factoren die uniek zijn voor uw situatie: De juiste pipet selecteren

Als je eenmaal het juiste instrument hebt, breng dan je goede pipetteertechniek in de praktijk. Stel een routinematig testschema op om het vertrouwen in uw resultaten in de loop van de tijd te maximaliseren en, zoals bij elk precisie-instrument, zorg ervoor dat u een regelmatig, deskundig onderhouds- en kalibratieregime instelt.

De eenvoudigste manier om snel de nauwkeurigheid van een pipet te testen, is de SmartCheck van RAININ. Meer informatie vindt u op mt.com/SmartCheck 

Het kiezen van de juiste pipet houdt in dat u uw vereisten evalueert. Ten eerste, wat voor soort monsters pipettert u? Zijn ze waterig? Of zijn ze stroperig, vluchtig, schuimend, corrosief of gevaarlijk? Voor waterige en bijna waterige vloeistoffen zijn de meest voorkomende luchtverdringingspipetten (ook wel "luchtkussen"-pipetten genoemd) een goede keuze. Voor viskeuze, vluchtige en andere ongebruikelijke vloeistoftypen zou een pipet met positieve verplaatsing een betere keuze zijn voor zowel de nauwkeurigheid als de veiligheid. 

Welk volume ga je pipetteren? Hoeveel monsters moet u van het ene vat naar het andere overbrengen? Bekijk deze white paper over pipetselectie om te begrijpen welke pipet het beste werkt, afhankelijk van de vloeistof en andere factoren die uniek zijn voor uw situatie.

Voor het pipetteren van de kleinst mogelijke volumes zijn gespecialiseerde instrumenten en technieken nodig. Een repeteerpipet is wellicht de beste keuze voor het herhalen van volumes tot 100 nL. Een andere pipet kan ook werken voor slechts een paar doses. Zorg ervoor dat u de kleinste pipet gebruikt die geschikt is voor het volume dat u wilt pipetteren. 

Bij zeer lage volumes heeft de pipetteertechniek een verhoudingsgewijs grotere impact op de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid. Dompeldiepte, pipetteerhoek en aspiratiesnelheid zijn belangrijk om te controleren. De poster over pipetteertechnieken van RAININ kan hierbij helpen.

Rainin NanoRep doseert aliquots tot 100 nL. Lees hier meer: mt.com/NanoRep

De belangrijkste factor voor nauwkeurig, reproduceerbaar meerkanaals pipetteren is de integriteit van de afdichting voor elk kanaal van de pipet. Dat betekent dat elke tip perfect op elke as past zonder luchtlekkage. Verschillende fabrikanten bereiken dit op verschillende manieren, met verschillende ergonomische gemaks- en afdichtingsconsistentieniveaus. De pipetpunten van het LTS LiteTouch-systeem van RAININ vereisen de minste kracht om te laden en uit te werpen vanuit meerdere kanalen, en ze sluiten elke keer weer consistent af.

Klik hier om het uitgebreide assortiment meerkanaalspipetten van RAININ te bekijken.

Houd bij het aanzuigen een pipet zo dicht mogelijk bij verticaal en vermijd elke hoek van meer dan 20° ten opzichte van de Y-as. Als u bij het doseren de wand van het doelvat aanraakt om alle vloeistof volledig van de punt te trekken, is het OK om de hoek van 20° te overschrijden.

Voorwaarts pipetteren is de standaard pipetteertechniek en de beste keuze voor waterige monsters. Voor stroperige en vluchtige monsters levert omgekeerd pipetteren een betere nauwkeurigheid.

Om de pipet vooruit te sturen, duwt u de zuiger naar beneden tot aan de eerste stop terwijl u de pipet buiten de vloeistof houdt. Dompel vervolgens de punt 2-10 mm diep onder in de vloeistof waarmee u werkt - niet dieper. Laat de zuiger langzaam los tot deze volledig is uitgerekt om het volledige vloeistofvolume op te zuigen. Om in uw doelvat te doseren, beweegt u de pipet in het vat en drukt u de zuiger vervolgens met een gelijkmatige snelheid door de eerste stop helemaal tot aan de tweede stop - tot aan de zuiger. Terwijl de zuiger volledig is ingedrukt, sleept u de punt van de pipet lichtjes langs de wand van het vat omhoog om te "toucheren". Dit helpt om het volledige vloeistofvolume volledig te doseren. Laat de zuiger los, werp de pipetpunt uit, plaats een nieuwe pipetpunt en herhaal.

Om de pipet om te keren, duwt u de zuiger helemaal naar beneden door de eerste stop naar de tweede stop - tot aan de zuiger. Dompel de punt vervolgens onder in vloeistof en laat de zuiger langzaam en gelijkmatig los om op te zuigen. Ga naar het ontvangende vat en druk de zuiger ALLEEN TOT DE EERSTE STOP om het juiste volume af te geven. Er blijft een klein restvolume achter in de pipetpunt. Beweeg de pipet over een opvangbakje en druk de zuiger helemaal naar beneden tot aan de tweede stop, ook wel de "blowout"-stop genoemd, om eventuele resterende vloeistof te laten ontsnappen. 

Laat de zuiger los, werp de pipetpunt uit, plaats een nieuwe pipetpunt en herhaal.

Een luchtverdringingspipet kan worden gebruikt om licht stroperige vloeistoffen, waaronder bloed, te pipetteren. Om maximale nauwkeurigheid te bereiken, gebruikt u de hierboven beschreven omgekeerde pipetteertechniek. Voor meer viskeuze vloeistoffen, zoals 85% glycerol of Triton X-100, biedt een verdringingspipet de beste nauwkeurigheid en consistentie.

Licht vluchtige vloeistoffen zoals ethanol kunnen worden gepipeteerd met een luchtverdringingspipet met behulp van de bovengenoemde omgekeerde pipetteertechniek. Pipetten met positieve verplaatsing zijn echter een betere keuze voor vluchtige vloeistoffen. 

Als u een luchtverdringingspipet gebruikt, spoel dan de pipetpunt ten minste vijf keer voor (opzuigen en doseren) voordat u uw volume pipetteert. Hierdoor wordt de lucht in de pipet in evenwicht gebracht, waardoor de verdampingssnelheid van de vloeistof wordt vertraagd. Door de snelle verdamping van vluchtige vloeistoffen zet de lucht in een pipet uit en wordt de vloeistof uit de punt geperst zonder dat er enige druk op de zuiger wordt uitgeoefend, waardoor de nauwkeurige volumeafgifte afneemt.

Vluchtige vloeistoffen zoals acetonitril kunnen over het algemeen beter worden behandeld met een verdringingspipet.

Ja, bij pipetteren met luchtverdringingspipetten kunnen aerosolen ontstaan. Aerosolen kunnen in het binnenste van de pipet terechtkomen en de binnenwanden en zuiger verontreinigen. Aërosolisatie treedt gemakkelijker op wanneer de zuiger te snel wordt losgelaten tijdens het opzuigen en kan ook in de tegenovergestelde richting buiten de pipet plaatsvinden bij een te snelle dosering. 

Om aërosolen tot een minimum te beperken, moet u langzaam en gelijkmatig aspireren en doseren. Gebruik gefilterde tips. 

Pipetten met positieve verplaatsing maken gebruik van spuitvormige tips die aërosolvorming voorkomen. Een pipet met positieve verplaatsing is de beste keuze voor het pipetteren van gevaarlijke vloeistoffen en vloeistoffen met een verhoogde viscositeit of vluchtigheid.

Zeer koude of hete vloeistoffen veranderen de luchtdruk in luchtverplaatsingspipetten, wat leidt tot onnauwkeurig pipetteren. 

Pipetten met positieve verplaatsing, met spuitvormige tips die geen luchtzak hebben tussen de vloeistof en de zuiger, worden niet beïnvloed door verschillende temperaturen van vloeistoffen. Pipetten met positieve verplaatsing leveren nauwkeurige resultaten met vloeistoffen die niet op kamertemperatuur zijn.

Als u een zeer hete of koude vloeistof moet pipetteren met een luchtverdringende pipet, spoel de pipetpunt dan niet voor. Dit is meestal de beste methode voor de hoogste nauwkeurigheid. In plaats daarvan moet u snel opzuigen en doseren om het effect van de temperatuur van de vloeistof op de binnenste luchtspleet van de pipet te minimaliseren.

Om luchtbellen en schuimvorming tijdens het pipetteren te voorkomen, dompelt u de punt niet verder dan 10 mm onder in het vloeistofreservoir en zuigt u langzaam op.

Omgekeerd pipetteren biedt extra bescherming omdat u voor het aanzuigen de zuiger volledig tot aan de 2e stop indrukt, zodat er geen kans is dat er lucht in het vloeistofmonster wordt geïnjecteerd. Ga naar deze pagina voor meer informatie over omgekeerd pipetteren. 

Een pipet met positieve verplaatsing veroorzaakt geen luchtbellen of schuim bij interactie met vloeistof, omdat de spuitvormige punt geen lucht biedt waarmee de vloeistof kan interageren.

Ontsmet een pipet door deze af te vegen met een natte doek en een reinigingsmiddel zoals isopropanol of een 10% bleekoplossing. Vermijd het doorzichtige plastic venster van de micrometer.

Autoclaveren kan een andere optie zijn, maar controleer de specificaties van uw pipet. Als het autoclaveerbaar is, is het hele instrument dan geautoclaveerd of alleen het vloeibare uiteinde?  Vaak kan alleen het vloeibare uiteinde worden geautoclaveerd.

Voor meer informatie over het reinigen van een pipet, download de poster voor het reinigen van een pipet .

Kalibratie is de gecontroleerde en gedocumenteerde meting van het systematische foutenpercentage (nauwkeurigheid) en het willekeurige foutenpercentage (precisie) van een pipet. In veel laboratoriumomgevingen moeten de prestaties van de pipet regelmatig worden getest en gedocumenteerd, volgens de wet onder specifieke omstandigheden die zijn gecertificeerd door een geaccrediteerde instantie. 

ISO-gecertificeerde leveranciers kalibreren pipetten in een gecontroleerde omgeving. De resultaten worden veilig gedocumenteerd op een kalibratiecertificaat, wat bijdraagt aan een auditklare prestatiegeschiedenis voor elk instrument. Wanneer aanpassingen nodig zijn, bieden ISO-gecertificeerde kalibratielaboratoria deskundige service met door de fabrikant aanbevolen onderdelen en smeermiddelen. 

Rainin en METTLER TOLEDO zijn 's werelds grootste pipetserviceorganisaties met snelle doorlooptijden van mail-in tot serviceopties op locatie. Servicelabs zijn ISO 17025-gecertificeerd en de procedures volgen de update van 2022 naar ISO 8655. 

De nauwkeurigheid van de pipet, of waarheidsgetrouwheid, zoals het nu wordt genoemd, is het verschil tussen het gemiddelde volume van alle metingen (4-10 metingen) en het ingestelde volume. 

Precisie is de standaarddeviatie van alle uitgevoerde metingen. Hoe ver liggen de andere uit elkaar tussen de andere lezingen?

De onzekerheid van een pipet is de kwantitatieve term voor de algehele nauwkeurigheid. Het is een combinatie van juistheid (een maat voor systematische fouten) en precisie (een maat voor willekeurige fouten). 

De vergelijking voor onzekerheid is: 

Onzekerheid = Systematische fout + willekeurige fout * k. k (dekkingsfactor of Z-score) is afhankelijk van het aantal metingen. k=3,31 voor vier metingen en 2 voor tien metingen.

Bewaar pipetten verticaal, hangend aan een plank of pipetstandaard. Houd pipetten schoon en vrij van verontreinigingen. Houd de rekken met pipetpunten gesloten.