Základné prvky UV Vis spektroskopie vrátane farebných stupníc, základov, prístrojov a kalibrácie
Prosím, popíšte svoj projekt. Zavolajte nám pre individuálnu ponuku /content/sk/sk/home/applications/Application_Browse_Laboratory_Analytics/uv-vis-spectroscopy/uvvis-spectroscopy-explained.fb.1.c.11.html
UV Vis spektroskopia je vedecká technika používaná na meranie množstva svetla, ktoré je absorbované alebo prepustené vzorkou pri rôznych vlnových dĺžkach ultrafialového (UV) a viditeľného (Vis) svetla.
Tento proces zahŕňa presvietenie vzorky lúčom UV Vis svetla a meranie množstva svetla, ktoré cez ňu prejde. Analýzou vzorca absorpcie a prenosu svetla môžu vedci identifikovať a kvantifikovať zložky vzorky.
Medzi látkou a jej UV Vis spektrom existuje jedinečný vzťah, keď látka absorbuje maximum svetla pri určitej vlnovej dĺžke. Tento vzťah sa dá použiť na:
Kvalitatívnu analýzu, t. j. určenie prítomnosti určitých látok.
Kvantitatívnu analýzu, t. j. určenie množstva určitých látok.
UV Vis spektrofotometria sa bežne používa v mnohých oblastiach vedy vrátane chémie, biológie a fyziky na štúdium vlastností materiálov a ich interakcií so svetlom. Široko sa využíva aj v priemysle na kontrolu kvality a analýzu materiálov, ako sú lieky, potraviny a kozmetika.
Táto stránka vám poskytne základné poznatky o UV vis spektroskopii a jej aplikáciách.
V nasledujúcich častiach nájdete odpovede na otázky o základoch a aplikáciách UV Vis:
UV Vis spektroskopia je druh absorpčnej spektroskopie, pri ktorej je vzorka osvetlená elektromagnetickým žiarením rôznych vlnových dĺžok v ultrafialovej (UV) a viditeľnej (Vis) oblasti. V závislosti od látky sú UV alebo viditeľné svetelné lúče vzorkou čiastočne absorbované. Zvyšné svetlo, t. j. prepustené svetlo, sa zaznamenáva ako funkcia vlnovej dĺžky vhodným detektorom. Detektor potom vytvorí jedinečné UV Vis spektrum vzorky (známe aj ako absorpčné spektrum).
Ak sa chcete dozvedieť viac o základoch UV Vis spektroskopie, stiahnite si príručku spoločnosti METTLER TOLEDO "Aplikácie a základy spektrofotometrie".
Keď svetlo dopadne na objekt, môže byť objektom absorbované, zvyčajne preto, že vlnová dĺžka absorbovaného svetla zodpovedá elektronickej excitácii v objekte. Zvyšné svetlo sa prenáša, t. j. prechádza cez objekt.
V spektrofotometri sa priepustnosť meria vydelením spektra intenzity svetla prechádzajúceho vzorkou (I) spektrom intenzity svetla prechádzajúceho slepou vzorkou (I0).
Prevodník absorbancie/priepustnosti
=
Absorpcia (A), známa aj ako optická hustota (OD), je množstvo svetla absorbovaného objektom a dá sa vyjadriť takto
Priepustnosť (T)
Ak sa chcete dozvedieť viac o základných poznatkoch o technikách UV Vis spektroskopie, stiahnite si príručku "Aplikácie a základy spektrofotometrie".
Čo je Beerov-Lambertov zákon?
Beerov-Lambertov zákon hovorí, že množstvo energie absorbovanej roztokom je úmerné dĺžke dráhy a koncentrácii. Jednoducho povedané, koncentrovanejší roztok absorbuje viac svetla ako zriedený roztok.
Matematické vyjadrenie Beerovho zákona je:
A = ϵ.d.c
Kde ϵ = molárna absorpčná schopnosť, d = dĺžka dráhy a c = koncentrácia. Molárna absorptivita je jedinečná fyzikálna konštanta vzorky, ktorá sa vzťahuje na schopnosť vzorky absorbovať svetlo pri danej vlnovej dĺžke. Jednotkou ϵ je L-mol-1-cm-1.
Ak sa chcete dozvedieť viac o základoch UV Vis spektroskopie, stiahnite si príručku spoločnosti METTLER TOLEDO "Aplikácie a základy spektrofotometrie".
Aký je rozdiel medzi skenovacími a radovými spektrofotometrami?
UV Vis spektrofotometer je prístroj určený na meranie absorbancie v UV Vis oblasti pomocou Beerovho-Lambertovho zákona. Meria intenzitu svetla prechádzajúceho cez roztok vzorky v kyvete a porovnáva ju s intenzitou svetla pred prechodom cez vzorku.
Hlavnými komponentmi UV Vis spektrofotometra sú zdroj svetla, držiak vzorky, disperzné zariadenie na oddelenie rôznych vlnových dĺžok svetla a vhodný detektor.
Skenovací spektrofotometer
Bežné skenovacie spektrofotometre pracujú na princípe postupného merania transmitancie pri každej definovanej vlnovej dĺžke. Svetlo sa rozdeľuje na rôzne vlnové dĺžky pomocou difrakčnej mriežky. Medzi difrakčnú mriežku a detektor sa umiestni kyvetka so vzorkou.
Spektrofotometer s maticou
V spektrofotometri s maticou je vzorka osvetlená kontinuom, t. j. všetkými spektrálnymi zložkami svetla naraz, a teda absorbuje svetlo rôznych vlnových dĺžok súčasne. Prechádzajúce svetlo sa potom difraguje reflexnou mriežkou. Toto prístrojové vybavenie pomáha získať UV Vis spektrum rýchlejšie, ako sa dá získať pomocou tradičného skenovacieho spektrofotometra.
V porovnaní so skenovacím spektrofotometrom nemá maticový spektrofotometer žiadne pohyblivé časti.
Ak sa chcete dozvedieť viac, stiahnite si dokument "Array versus Scanning". Biela kniha porovnáva dve zavedené zostavy UV Vis spektrofotometrov a hodnotí ich výkon a výhody.
Spektrofotometrický prístroj musí fungovať v súlade so svojimi špecifikáciami pre kritické merania UV Vis, najmä v klinickej, farmaceutickej alebo priemyselnej kontrole kvality. Preto sa musí pravidelne vykonávať overovanie výkonu. Výsledky kalibrácie sa musia tiež zaznamenávať a uchovávať.
Stiahnite si publikáciu "Ako by mali UV Vis laboratóriá robiť kalibráciu spektrofotometrov", aby ste získali prehľad o význame kalibrácie vzhľadom na revízie kapitoly o UV Vis, ktoré sa nachádzajú v publikácii Ph. Eur. 10 a USP42 NF37.
Presnosť: ± 0,010 A alebo ± 1 %, podľa toho, ktorá hodnota je vyššia
Kyselina nikotínová v
0,1 M HCl
Slepý pokus: 0,1 M HCl
12 mg/l
0,26 A - 1,6 A
213, 261 nm
Fotometrická linearita
K2Cr2O7 v 0,001 M HClO4
Slepý pokus: 0,001 M HClO4
6 - 200 mg/l, do 3,0 A,
235, 257, 313, 350 nm
Všetky merané filtre spĺňajú kritériá akceptovateľnosti fotometrickej presnosti
R2> 0,999
Kyselina nikotínová v
0,1 M HCl
Slepý pokus: 0,1 M HCl
6 - 60 mg/l, do 2,5 A
213, 261 nm
Rozptylové svetlo podľa postupu A
(SFRM)
1,2 % w/v KCl/H2O;
Dĺžka dráhy 10 mm
Slepý pokus: 1,2 % w/v KCl/H2O, dĺžka dráhy 5 mm
Amax pri 198 nm
≥ 0.7 A
(NA)
Rozptylové svetlo podľa postupu B (SWM)
1,2 % w/v KCl/H2O;
Dĺžka dráhy 10 mm
Slepá položka: H2O, dĺžka dráhy 10 mm
Amax pri 198 nm
≥ 2.0 A
≥ 2.0 A
Rozlíšenie
0,02 % obj. toluénu v n-hexáne
Slepý pokus: n-hexán/
n-heptán (Ph. Eur. 10)
Amax,269/Amin,267
>1.3
Hladiny sú uvedené v príslušnej monografii
** Žiadna špecifikácia fotometrickej opakovateľnosti (presnosti) v Ph. Eur.
S.D. - štandardná odchýlka
3. Veda o farbách
Základy merania farieb
Farby robia náš svet zaujímavejším. Keď vidíme nejaký objekt, svetlo odrazené od objektu vstupuje do našich očí a je zachytené niekoľkými typmi fotoreceptorov v sietnici. V závislosti od citlivosti fotoreceptorov môžu rôzni ľudia vnímať tú istú farbu rôzne.
Aby bolo možné univerzálne akceptovať presnosť určitej farby, je potrebné priradiť číselné hodnoty. Stručne povedané, meracie zariadenia, ako sú spektrofotometre a kolorimetre, poskytujú výsledky merania farieb ako hodnoty, aby sa zabezpečila presnosť a opakovateľnosť určenia farby.
Spektrofotometre kvantifikujú údaje o farbe zhromažďovaním a filtrovaním vlnových dĺžok prenášaných cez vzorku. Na spektrálne údaje sa aplikuje matematická rovnica, ktorá zobrazí farbu na farebnej stupnici.
Farebná stupnica CIE (Commission internationale de l'éclairage) je definovaná pomocou troch parametrov: odtieň, farba a svetlosť.
Odtieň je dominantná farba objektu. Primárne a sekundárne farby spolu tvoria odtieň.
Chroma, známa aj ako sýtosť, opisuje, aká živá alebo matná je farba.
Svetlosť je svetelná intenzita farby (či je tmavá alebo svetlá).
Každý farebný systém CIE používa tri súradnice na umiestnenie farby na stupnici. Tri základné farebné stupnice sú Tristimulus CIE XYZ, CIE L*a*b* a CIE L*u*v*.
Napríklad, keď je farba vyjadrená v CIE L*a*b*:
L* definuje svetlosť
a* označuje hodnotu červenej/zelenej farby
b* označuje žltú/modrú hodnotu
Pri použití farebnej stupnice CIE L*a*b* by súradnice červenej farby zobrazenej ruže boli:
L* = 29,00, a* = 52,48, b* = 22,23
Ak sa chcete dozvedieť viac o základoch merania farieb, stiahnite si príručku.
Farba je kľúčovým faktorom na okamžité rozpoznanie.
Poskytnutie celkového úspešného vizuálneho zážitku spotrebiteľom môže ovplyvniť rozhodnutie o kúpe. Preto je farba dôležitá pri definovaní identity značky a konzistentnosti výrobku.
Na jednoznačné definovanie výrobku podľa priemyselných noriem sú stanovené rôzne stupnice farieb. Tieto stupnice zahŕňajú:
Stupnica
Štandard
Aplikácie
Saybolt
ASTM D156, ASTM D6045
Na zistenie, či je palivo (petrolej, benzín, nafta, ťažký benzín atď.) kontaminované alebo či došlo k jeho degradácii počas skladovania
APHA/Pt-Co/Hazen
ASTM D1209
Index žltosti používaný ako metrika na kontrolu čistoty vo vodnom, chemickom, ropnom a plastovom priemysle
Gardner
ASTM D1544/D6166, DIN EN ISO 4630-2
Na testovanie výrobkov, ako sú živice, mastné kyseliny, laky a sušiace sa oleje, ktoré získali farbu zahriatím
CIELAB
DIN EN 11664-4, DIN 5033-3, 4630, ASTM Z 58.7.1 DIN 6174
Kontrola kvality pre aromatický a voňavkársky priemysel a potravinársky a nápojový priemysel
Metóda MEBAK 2.13.2, metóda EBC 8.5, metóda EBC 9.6
Na meranie intenzity farby a zákalu (zákalu) v jednotkách EBC piva, sladu, karamelu atď.
USP/EUP
Monografia USP-24 631, metóda EP 2.2.2
Kontrola kvality liečiv
Hess-Ives
Skúšobná metóda DGK F 050.2
Používa sa na testovanie chemických látok a povrchovo aktívnych kvapalín (najmä v kozmetickom priemysle)
4. Analýza mikroobjemov pomocou UV Vis spektrofotometra
Ako vykonať analýzu mikroobjemov v UV Vis spektroskopii?
Mikroobjemový spektrofotometer meria objemy vzoriek už od 1 µl. Koncentrácia nukleových kyselín vo vzorke je zvyčajne rádovo v nano- alebo mikrogramoch na mililiter.
Zriedenie takýchto mikroobjemov a získanie presných výsledkov je náročné. Preto sa mikroanalýza bez riedenia stáva dôležitou pre následnú analýzu nukleových kyselín.
Pri analýze nukleových kyselín sa mikroobjem vzorky pipetuje do jemnej priehradky na povrchu podstavca. Svetelný lúč zo zdroja lampy je vedený optickými vláknami na mikroobjemovú platformu. Keďže dĺžka dráhy je skrátená na rádovo milimetre, možno presne analyzovať vyššiu koncentráciu analytu bez viacnásobného riedenia.
Systém mikroobjemov využíva technológiu optických vlákien spolu s vlastnosťami vzorky (ako je povrchové napätie) na udržanie vzorky na podstavcovej platforme a stanovenie absorbancie vzoriek v reálnom čase pri malých objemoch.
Vďaka týmto výhodám sa mikroobjemová analýza stáva ideálnou voľbou pre biomolekulárnu analýzu.
Zúčastnite sa webinára na požiadanie "Maximalizujte presnosť pracovného postupu prostredníctvom správnej praxe UV/VIS pri analýzach nukleových kyselín", kde nájdete tipy a triky týkajúce sa analýzy mikroobjemov.
Kontrola kvality nukleových kyselín Kvantitatívna analýza nukleových kyselín je základnou predanalytickou metódou na získanie presných a spoľahlivých výsledkov v mnohých molekulárno-biologických testoch, ako je sekvenovanie novej generácie (NGS), polymerázová reťazová reakcia (PCR), PCR v reálnom čase (kvantitatívna PCR; qPCR), klonovanie a transfekcia.
Kvalitatívnu a kvantitatívnu kontrolu nukleových kyselín možno vykonávať stanovením čistoty a koncentrácie nukleových kyselín.
Metódy analýzy DNA A260 udáva koreláciu koncentrácie nukleotidov a A280 udáva koncentráciu zvyškových proteínov. Aminokyseliny tyrozín a tryptofán absorbujú pri 280 nm a fenylalanín dobre absorbuje pri 260 nm. To umožňuje vypočítať pomer A260/A280 pre čistotu DNA pomocou priamych meraní absorbancie. Kvalitná DNA bude mať pomer A260/A280 1,7-2,0
Testy na kvantifikáciu proteínov Rôzne metódy kvantifikácie celkových bielkovín zahŕňajú A280, kyselinu bicinchonínovú (BCA), Bradfordove, Lowryho, Pierceove a iné nové testy. Bielkoviny v roztokoch majú maximá pri 280 nm v dôsledku aminokyselín s aromatickými kruhmi a minimá pri približne 220 nm v dôsledku prítomnosti peptidových väzieb.
Koncentrácia sa vypočíta pomocou Warburgovho vzorca:
Koncentrácia bielkovín (mg/ml) = 1,55 X (údaj A280) - 0,76 X (údaj A260)
Ak sa chcete dozvedieť viac o analýze DNA pomocou UV Vis spektroskopie, stiahnite si redakčný materiál aplikácie "Pomer 260/280: Ukazovateľ kontaminácie bielkovinami".
Aké sú bežné chyby pri meraní a kalibrácii UV víza?
Dobrú presnosť a správnosť meraní UV Vis možno dosiahnuť prijatím opatrení na zabránenie chybám. Typické riziká chýb, ktoré by sa mali zohľadniť pri meraniach UV Vis, zahŕňajú:
Spektrálne charakteristiky. Spektrálna charakteristika sa vykonáva počas procesu kalibrácie. Hlavné faktory, ktoré môžu viesť k chybným výsledkom, sú presnosť vlnovej dĺžky, šírka spektrálneho pásma, rozptýlené svetlo a linearita.
Fotometrické charakteristiky. Fotometrické charakteristiky zahŕňajú spektrálnu citlivosť zdroja svetla, citlivosť zdroja svetla a detektora v závislosti od teploty atď.
Optické interakcie. Žiarenie svetelného zdroja môže interagovať s materiálom kyvety, čím sa mení intenzita absorpcie vzorky. Takýmto optickým interakciám sa dá predísť výberom správneho materiálu kyvety.
Rôzne faktory. Merania nepriaznivo ovplyvňujú aj iné faktory, ako je teplota, kolísanie napätia linky, vibrácie, znečistenie alebo zahrievanie vzorky fotometrom.
GUVP™
Hoci nie všetkým chybám sa dá vyhnúť, chyby sa dajú minimalizovať, aby sa dosiahli lepšie výsledky.
'Stiahnite si brožúru Správna UV/VIS prax "Dôveryhodné výsledky UV/Vis spektroskopie".
Výber správnej kyvety zahŕňa výber správneho materiálu a správnej veľkosti na základe vzorky a prístrojového vybavenia.
Materiál kyvety by mal mať dostatočnú priepustnosť pri danej vlnovej dĺžke. Tlmenie svetla na stenách kyvety by nemalo ovplyvniť výsledok analýzy. Sklenené kyvety sa nepoužívajú v UV oblasti na analýzu pod 370 nm, pretože absorbujú žiarenie. Odporúča sa používať ich len vo viditeľnej oblasti.
V nasledujúcej tabuľke sú uvedené použiteľné rozsahy prenosu kyvet:
Materiál
Teoretický rozsah prenosu (nm)
Kremeň pre ďaleké UV žiarenie
170-2700
Optické sklo
320-2500
Kremeň pre blízke IR žiarenie
220-3800
UV oxid kremičitý
220-2500
UV plast
220-900
Jednorazová PS bunka
340-750
Jednorazová bunka z PMMA
285-750
Na možnosti merania má vplyv aj veľkosť kyvety. Nominálna dĺžka dráhy žiarenia kyvety je 10 mm. V závislosti od vzoriek sa dĺžka môže meniť od 1 mm do 100 mm.
Štandardné kyvety sa môžu použiť pre väčšinu skúmaných vzoriek. Bežné absorpčné a fluorescenčné kyvety majú vonkajšiu základňu 12,5 mm x 12,5 mm, výšku 45 mm a vnútorné rozmery 10 mm x 10 mm.
Kyvety sdlhou dráhou (kyvety s dĺžkou dráhy viac ako 10 mm) sa používajú, ak je vzorka príliš zriedená alebo ak sa vzorka počas merania odparuje alebo podlieha chemickej zmene.
Kyvety skrátkou dráhou (kyvety s dĺžkou dráhy menšou ako 10 mm) sa používajú, keď je absorbancia vysoká a riedenie je ťažké.
Ako správne zaobchádzať s kyvetami?
Pri manipulácii s kyvetami vždy prenášajte kyvetu matnými stranami. Nedotýkajte sa priehľadných optických povrchov prstami, pretože odtlačky prstov môžu spôsobiť výraznú absorpciu, a tým ovplyvniť presnosť.
Na plnenie kyvety nepoužívajte sklenené Pasteurove pipety, pretože by mohli poškriabať optický povrch a spôsobiť ďalšie rušenie. Odporúčajú sa pipety s jednorazovými plastovými špičkami.
Čistota kyviet má veľký vplyv na výsledky, preto ju musíme považovať za veľmi dôležitý faktor.
Na hĺbkové čistenie kremenných kyviet sa odporúčajú nasledujúce kroky:
Namočte kyvety do čistiaceho roztoku.
Odstráňte čistiaci roztok a kyvety opláchnite deionizovanou vodou.
Kyvety umyte etanolom alebo acetónom, okrem prípadov, keď ide o bielkoviny (pozri tabuľku nižšie).
Kyvety osušte utretím handričkou, ktorá nepúšťa vlákna, a následne vysušte na vzduchu alebo v sušičke.
V nasledujúcej tabuľke sú uvedené použiteľné rozsahy prenosu kyvet.
Vodné roztoky
Organické molekuly
Ťažko odstrániteľné častice
Proteíny
Ťažké kovy
Mastné kyseliny
Čistiace roztoky
Rovnaké objemové diely 3 M HCl a etanolu
Premyte 50 % kyselinou dusičnou
Koncentrovaná HNO3 alebo 2 M HCl
Rovnaké objemové diely etanolu a 3 M HCl
Inkubujte pri izbovej teplote s trypsínom
(Etanol a acetón sa na čistenie neodporúčajú.)
Rovnaké objemové diely 2 M kyseliny sírovej a 50 % deionizovanej vody
Aqua regia
Rovnaké objemové diely IPA a deionizovanej vody
Čas namáčania*
10 minút
10 minút
30 sekúnd
Cez noc
20 minút
Utrite
*Čas namáčania uvedený v tabuľke je hrubý odhad; odporúča sa však namáčať kyvety len dovtedy, kým sa neodstránia škvrny/kontaminanty.
Sklenené kyvety sa môžu čistiť opláchnutím kyvety acetónom alebo etanolom a následným opláchnutím vodou. Odporúča sa sušenie na vzduchu.
Plastové kyvety sa môžu niekoľkokrát umyť deionizovanou vodou. Umývanie plastových kyviet chemikáliami sa neodporúča.
Stiahnite si našu zbierku plagátov s tipmi a trikmi na udržiavanie čistoty laboratórnych prístrojov
Správna prax pri používaní mikroobjemových spektrofotometrov
Príprava vzorky Citlivosť prístroja môže byť pri zriedených koncentráciách biologických vzoriek nízka. Ak chcete zvýšiť citlivosť takýchto vzoriek, zvážte odber vyššej koncentrácie vzorky. Pri meraniach mikroobjemu je zvyčajne potrebný objem vzorky 1 - 2 µl. Na odber vzorky použite kalibrované pipety. Je potrebné dbať na to, aby sa pripravila homogénna vzorka, ktorá sa odoberie na analýzu.
Vyčistite mikroobjemovú platformu Uistite sa, že povrch podstavca pre mikroobjem a zrkadlo sú riadne vyčistené. Povrchy jednoducho utrite handričkou, ktorá nepúšťa vlákna, pomocou deionizovanej vody. Ak používate tlmivý roztok, detergenty alebo lepkavú vzorku, vyčistite povrch viackrát predtým, ako budete pokračovať v ďalšej vzorke.
Umiestnite vzorku na plošinu Pomaly a rovnomerne umiestnite vzorku na povrch, aby ste zabránili tvorbe bublín.
Pracujte v rámci detekčných limitov Poznajte najnižšie a najvyššie detekčné limity prístroja a pracujte v tomto rozsahu.
Všeobecné postupy pre presné meranie UV žiarenia
Pri príprave vzorky a jej pipetovaní do kyvety alebo na mikroobjemovú platformu buďte opatrní. Vzorka by mala byť homogénna.
Ak sú vo vzorke prítomné akékoľvek suspendované pevné častice, svetlo sa môže rozptýliť. V takýchto prípadoch vzorku prefiltrujte pomocou injekčného filtra.
Vzorku naplňte do kyvety s ohľadom na rozmer z držiaka vzorky. Tým sa zabezpečí, že svetlo prechádza vzorkou. z-rozmer je vzdialenosť od dna kyvety po výšku, v ktorej svetelný lúč prechádza vzorkou.
Pred každým meraním očistite kyvetu handričkou, ktorá nepúšťa vlákna. Zakaždým použite nové tkanivo.
Ako slepý pokus použite to isté rozpúšťadlo/roztok pufra, ktorý bol použitý pri príprave vzorky.
6. Aké sú aplikácie UV Vis spektroskopie v rôznych odvetviach?
UV Vis spektroskopia je univerzálna analytická technika so širokou škálou aplikácií v rôznych priemyselných odvetviach. Niektoré z významných aplikácií UV Vis spektroskopie v rôznych priemyselných odvetviach sú:
Potraviny a nápoje
UV Vis spektroskopia určuje kvalitu a zloženie potravín a nápojov. Môže sa použiť na analýzu farby (napr. vína), chuti a vône potravinárskych výrobkov, ako aj na zistenie prítomnosti kontaminantov alebo falzifikátov.
Farmaceutické
UV Vis spektroskopia analyzuje čistotu, koncentráciu a identitu liečiv a iných farmaceutických výrobkov. Používa sa aj na monitorovanie stability farmaceutických výrobkov v čase.
Kozmetika
Hodnotenie fotostability látok pre prípravky, charakterizácia častíc UV blokátora, hodnotenie farebného indexu, zisťovanie falšovania (parfumérsky priemysel), štúdium optických vlastností, kvantifikácia farbív, antioxidantov atď.
Petrochémia
Charakterizácia ropy, výpočet asfalténových frakcií, formulácia indexov pre obsah aromátov, kvalita ropy, obsah síry, výpočet Hildebrandovho faktora rozpustnosti (rozšírené na bitúmen, ťažké a bridlicové oleje a oleje z fluidného katalytického krakovania, koksovania alebo skvapalňovania uhlia)
Chemické
Stanovenie chemických vlastností, konečné hodnotenie kvality hotového výrobku, štúdium zloženia polymérov, kvalifikácia odpadových vôd, stanovenie čistoty a účinnosti farbenia, fotokatalytická degradácia polymérov/ farbív, zvyšky pesticídov v pôde alebo vode
Biotechnológie
Koncentrácia a čistota nukleových kyselín, proteínov (A280, BCA, Biuret, Bradford Lowry, OD 600), merania mikrobiálnych bunkových kultúr, denaturácia proteínov, kinetické štúdie (enzymatická aktivita), biologické vzorky ako krv, plazma, sérum atď.
Spoločnosť METTLER TOLEDO ponúka širokú škálu overených aplikačných metód. Nájdite si aplikáciu, ktorá najlepšie vyhovuje vašim potrebám, prostredníctvom nášho online vyhľadávača.
Rôzne spektroskopické techniky sa rozlišujú najmä podľa žiarenia, ktoré používajú, interakcie medzi energiou a materiálom a typu materiálu a aplikácií, na ktoré sa používajú. Na chemickú analýzu sa bežne používajú tieto spektroskopické techniky: atómová spektroskopia, ultrafialová a viditeľná spektroskopia (UV Vis spektroskopia), infračervená spektroskopia, Ramanova spektroskopia a jadrová magnetická rezonancia.
Typ spektroskopie
Typ žiarenia
Interakcie
Vlnová dĺžka
ϒ žiarivá spektroskopia
ϒ-žiarenie
Atómové jadrá
< 0,1 nm
Röntgenová fluorescenčná spektroskopia
X - lúče
Elektróny vnútorného obalu
0,01 - 2,0 nm
Vákuová UV spektroskopia
Ultrafialové žiarenie (UV)
Ionizácia
2,0 - 200 nm
UV Vis spektroskopia
UV Vis spektroskopia
Valenčné elektróny
200 - 800 nm
Infračervená a Ramanova spektroskopia
Infračervená
Molekulové vibrácie
0,8 - 300 mm
Mikrovlnná spektroskopia
Mikrovlny
Molekulové rotácie
1 mm až 30 cm
Elektrónová spinová rezonančná spektroskopia
Elektrónový spin
Jadrová magnetická rezonančná spektroskopia
Rádiové vlny
Jadrový spin
0.6 - 10 m
Aké sú rôzne molekulové interakcie v UV oblasti?
Absorpcia UV žiarenia vedie k elektronickým prechodom z nižších energetických hladín na vyššie energetické hladiny. Absorpcia ultrafialového žiarenia v organických molekulách je obmedzená na určité funkčné skupiny (chromofóry), ktoré obsahujú valenčné elektróny s nízkou excitačnou energiou. Molekulové prechody/interakcie, ktoré sa uskutočňujú v dôsledku absorpcie UV žiarenia, sú:
π- π* (prechod z hviezdy pi na hviezdu pi) - väzbový orbitál na antiväzbový orbitál
n - π* (prechod n na pi hviezdu) - nevazebné orbitály na antivazebné
Tieto prechody potrebujú nenasýtenú skupinu v molekule, ktorá poskytne π elektróny.
Prechody σ (väzbový) na σ* (antiväzbový) si vyžadujú vyššiu energiu, a preto ich nemožno zistiť pomocou UV Vis spektroskopie.
Ako funkčné skupiny ovplyvňujú spektrá?
Uvažujte o funkčnej skupine obsahujúcej atómy s jedným alebo viacerými osamelými elektrónovými pármi, ktoré neabsorbujú ultrafialové/viditeľné žiarenie. Keď sa však táto funkčná skupina pripojí k chromofóru, zmení intenzitu a vlnovú dĺžku absorpcie. Tento jav sa nazýva auxochrom alebo skupina zvyšujúca farebnosť.
Prítomnosť auxochrómu spôsobuje posun polohy píku alebo signálu na dlhšiu vlnovú dĺžku, čo sa nazýva batochromický alebo červený posun. Funkčné skupiny, ktoré prispievajú k batochrómnym skupinám, sú substituenty, ako sú metyl, hydroxyl, alkoxy, halogén a aminoskupiny.
Auxochróm, ktorý spôsobuje posun polohy píku alebo signálu na kratšiu vlnovú dĺžku, sa nazýva hypochrómny alebo modrý posun. Kombinácia chromofóru a auxochrómu sa vlastne správa ako nový chromofór, ktorý má iné absorpčné maximum (λmax). Napríklad benzén vykazuje λmax pri 256 nm, zatiaľ čo anilín vykazuje λmax pri 280 nm. Preto sa skupina NH2 správa ako auxochróm a spôsobuje posun λmax na väčšiu hodnotu.
Aký je rozdiel medzi spektrálnou šírkou pásma a rozlíšením v UV Vis spektroskopii?
Spektrálna šírka pásma (SBW) spektrofotometra súvisí s fyzickou šírkou štrbiny a optickou disperziou systému monochromátora. Rozlišovacia schopnosť je schopnosť prístroja rozdeliť svetlo do konečných, odlišných oblastí vlnovej dĺžky a rozlíšiť každú konečnú oblasť. Spektrálna šírka pásma sa zvyčajne používa pri skenovacích prístrojoch, zatiaľ čo rozlíšenie sa zvyčajne používa pri prístrojoch so sústavou.
Na väčšinu kvantitatívnych účelov liekopisu postačuje spektrálna šírka pásma menšia ako 2 nm a kritérium prijateľnosti pre pomer je 1,3. Spektrálne rozlíšenie sa môže použiť na porovnanie so spektrálnou šírkou pásma.
V tabuľke je uvedené rozlíšenie spektrofotometrov UV/VIS Excellence spoločnosti METTLER TOLEDO, ktoré sa meria pomocou toluénu v hexáne, a ekvivalentný SBW.
Prístroj
Spektrálne rozlíšenie
Ekvivalentná SBW (nm)
UV5
> 1.5
< 2.0
UV5Bio
> 1.5
< 2.0
UV5Nano
> 1.7
< 1.5
UV7
> 1.9
≤ 1.0
Aké rôzne zdroje svetla sa používajú v UV Vis spektrofotometri?
Najlepší zdroj svetla by mal byť taký, ktorý poskytuje dobrú intenzitu s nízkym šumom vo všetkých ultrafialových a viditeľných vlnových dĺžkach a ponúka stabilitu počas dlhého obdobia. Existuje celý rad svetelných zdrojov, ktoré sa bežne používajú, ako je uvedené nižšie.
Zdroj svetla
Rozsah vlnovej dĺžky
(nm)
Oblasť
Životnosť
Žiarovka s volfrámovým vláknom
350 - 2500
VIS + IR
3 000 hod.
Deutériová oblúková lampa
190 - 400
UV ŽIARENIE
1 000 h
Vodíková lampa
190 - 400
UV
1 000 hod.
Xenónová výbojka
190 - 1100
UV + VIS + NIR
5 500 hodín*
* Zodpovedá 50 Hz zábleskom pri stálej prevádzke
V čom je difrakčná mriežka lepšia ako hranol?
Prizmy a difrakčné mriežky sú typické disperzné prvky. Hranol dosahuje disperziu vďaka rozdielu v indexe lomu materiálu v závislosti od vlnovej dĺžky. Difrakčná mriežka však využíva rozdiel v smere difrakcie pre každú vlnovú dĺžku v dôsledku interferencie. Tak hranoly, ako aj difrakčné mriežky môžu na analýzu rozložiť svetelné spektrá do mnohých farieb. Difrakčná mriežka je však menej citlivá na farbu svetla a môže byť vyrobená tak, aby rozložila farby vo väčšom uhle ako hranol. Sklo v hranole je číre pre viditeľné svetlo, ale absorbuje a blokuje svetlo v infračervenej a ultrafialovej časti spektra. Difrakčná mriežka s niekoľkými stovkami riadkov na palec môže odkloniť svetlo v strede viditeľného spektra najmenej o 20 stupňov. Uhol vychýlenia skleneného hranola je vo všeobecnosti oveľa menší.
Ktoré anorganické zlúčeniny možno merať pomocou UV vis spektroskopie?
Molekuly možno analyzovať pomocou UV Vis spektroskopie, ak majú akúkoľvek funkčnú skupinu alebo konjugáciu, alebo ak vytvárajú farebný komplex. Keďže anorganické zlúčeniny neobsahujú žiadnu funkčnú skupinu ani konjugáciu, bežnou metódou ich analýzy je reakcia s vhodnou zlúčeninou. Vzniká farebný komplex, ktorého absorbancia sa dá fotometricky merať vo viditeľnej oblasti a korelovať s jeho skutočnou koncentráciou. Napríklad železo sa bežne analyzuje reakciou s 1,10-fentrolínom, čím vzniká červený farebný komplex. Absorbancia komplexu sa meria pri vlnovej dĺžke 570 nm, aby sa odhadla koncentrácia železa.
Ako sa líšia jednopaprskové a dvojpaprskové spektrofotometre?
Hlavný rozdiel medzi jednopaprskovým a dvojpaprskovým spektrofotometrom je nasledovný.
Jednopaprskový spektrofotometer: Jeden lúč zo zdroja svetla prechádza vzorkou
Dvojitý lúčový spektrofotometer: Svetelný lúč zo zdroja svetla je rozdelený na dve časti: jedna časť prechádza vzorkou a druhá časť prechádza referenčným spektrometrom.
Rozdelenie lúča v dvojlúčovom spektrofotometri sa dosahuje dvoma spôsobmi:
staticky, pomocou čiastočne prepúšťajúcich zrkadiel alebo podobného zariadenia
zoslabením lúčov pomocou pohyblivých optických a mechanických zariadení
Ako analyzovať pevný polymérny film pomocou UV Vis?
Analýza pevnej vzorky sa vykonáva najmä odhadom jej absorbancie, transmitancie a odrazivosti. Medzi bežné parametre stanovené pre pevné polyméry patria % priepustnosť, medzná vlnová dĺžka a index žltosti. Vzorka sa upevní na držiak špeciálne navrhnutý pre pevné vzorky a údaje sa odčítajú rovnakým spôsobom ako pri kvapalných vzorkách. Držiak pevných vzoriek umožňuje meranie pevných vzoriek, ako sú filmy alebo sklo.
Má teplota vplyv na analýzu UV Vis?
Teplota ovplyvňuje hodnoty absorbancie. Rôzne rozpúšťadlá podliehajú rôznym interakciám pri rôznych teplotách. Parametre roztokov, ktoré sa menia v dôsledku zmien teploty, sú:
Rýchlosť reakcie. Rýchlosť sa mení pri zvýšenej teplote. To môže spôsobiť zmenu aktivity vzorky. Enzymatické/biomolekulárne reakcie sú veľmi citlivé na teplotu.
Rozpustnosť rozpustenej látky. Rozpustnosť je ovplyvnená zmenami teploty. Zlá rozpustnosť môže mať za následok nepresnú absorpciu.
Rozpínanie alebo zmršťovanie rozpúšťadla. To môže viesť k zmene koncentrácie roztoku a ovplyvniť absorbanciu, keďže absorbancia lineárne súvisí s koncentráciou.
Schlierenov efekt. Tento efekt môže nastať pri zmenách teploty, čo vedie k sérii konvekčných prúdov, ktoré môžu zmeniť skutočnú absorbanciu.
Parametre optického výkonu, ako je fotometrický šum, presnosť/opakovateľnosť vlnovej dĺžky, opakovateľnosť fotometrických meraní a rozptýlené svetlo, nie sú ovplyvnené teplotou v rozsahu 10 - 40 °C.
Zatiaľ čo optické parametre ako fotometrické rozlíšenie (pomer toluén/hexán) a fotometrická presnosť vlnovej dĺžky (K2Cr2O7 v HClO4) vykazujú závislosť od teploty v rozsahu od 0,014 do -0,034/jednotku v rozmedzí 10 - 40 °C.
Reguláciu teploty pre UV Vis spektrofotometriu možno dosiahnuť pomocou vysoko výkonných termostatických systémov, ako sú CuveT a CuvetteChanger. Viac informácií nájdete tu.
Čo je rozptýlené svetlo?
Rozptýlené svetlo je definované ako svetlo, ktoré sa dostane k detektoru a ktoré nepochádza zo zdroja svetla prístroja a nesleduje optickú dráhu, čo spôsobuje odchýlku na korešpondujúcej vlnovej dĺžke. Preto je intenzita svetla nameraná detektorom vyššia, ako by v skutočnosti mala byť. Na druhej strane to tiež znamená, že nameraná absorbancia je nižšia ako skutočná absorbancia, pretože je znížená o príspevok rozptýleného svetla. Tento efekt je výraznejší pri vyšších hodnotách absorbancie (vysoké koncentrácie vzorky).
Stiahnite si bielu knihu a dozviete sa viac o pôvode a presnom meraní rozptýleného svetla:
Prečo je priestor pre vzorku v spektrofotometroch s UV Vis Array otvorený?
Priehradka na vzorky v spektrofotometroch s UV Vis maticou je otvorená z dôvodu, že prístroje s maticou používajú reverznú optiku a súčasnú detekciu všetkých vlnových dĺžok spektra.
Reverzná optika: Svetlo sa po prechode vzorkou difraguje. Z tohto dôvodu k signálu v danej oblasti vlnových dĺžok prispieva len malá časť vonkajšieho okolitého svetla.
Simultánna detekcia: Pomocou sústavy detektorov, ktorá poskytuje 2048 signálov intenzity svetla súčasne, sa celé spektrum zaznamená v priebehu jednej sekundy. Keďže meranie je veľmi rýchle, vplyv okolitého svetla sa výrazne znižuje.
Aplikácie
Stiahnite si špecifické príručky pre UV Vis spektroskopiu nižšie
