Fundamentos, instrumentación, calibración, escalas de color y mucho más
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La espectroscopia ultravioleta-visible (UV-VIS) es una potente técnica para diversas aplicaciones de distintas industrias y segmentos de mercado.
Cuando una sustancia absorbe el máximo de luz a una determinada longitud de onda, se da una relación única entre la sustancia y su espectro UV-VIS. Esta relación puede servir para:
Análisis cualitativos, es decir, determinar la presencia de ciertas sustancias. Por ejemplo, la determinación del contenido de DOBI y caroteno en aceites y grasas comestibles, la identificación de contaminación, como el cromo y el hierro en el agua,la identificación de la cianocobalamina y la comprobación de la pureza del ADN/ARN.
Análisis cuantitativos, es decir, determinar las cantidades de ciertas sustancias. Por ejemplo, la determinación de la concentración de sustancias en el agua, como la DQO o el amoníaco, la determinación de la unidad de amargor de las bebidas alcohólicas, la medición del contenido de azúcar en las bebidas y la cuantificación de las proteínas.
En esta página, descubrirá conceptos básicos sobre la espectroscopia ultravioleta-visible y sus aplicaciones.
Obtenga respuesta a sus preguntas acerca de los fundamentos y aplicaciones de UV-VIS en las siguientes secciones:
1. Fundamentos de la espectroscopia ultravioleta-visible
¿Qué es la espectroscopia ultravioleta-visible?
La espectroscopia ultravioleta-visible es un tipo de espectroscopia de absorción en la que se ilumina una muestra con rayos electromagnéticos de varias longitudes de onda en el rango ultravioleta (UV) y visible (VIS). Según la sustancia, la muestra absorbe parcialmente los rayos de luz ultravioleta o visible. El resto de la luz, es decir, la luz transmitida, se registra como una función de la longitud de onda mediante un detector adecuado. El detector produce entonces el espectro UV-VIS único de la muestra (también conocido como el “espectro de absorción”).
Para obtener más información sobre los fundamentos de la espectroscopia ultravioleta-visible, descargue la guía “Aplicaciones y fundamentos de la espectrofotometría” de METTLER TOLEDO.
Cuando la luz incide en un objeto, este puede absorberla, normalmente porque la longitud de onda de la luz absorbida corresponde a una excitación electrónica en el objeto. El resto de la luz se transmite, es decir, atraviesa el objeto.
En un espectrofotómetro, la transmitancia se mide dividiendo el espectro de intensidad de la luz transmitida a través de una muestra (I0) por el espectro de intensidad de la luz transmitida a través del blanco (I).
Conversor de absorbancia/transmitancia
=
La absorbancia (A), también conocida como “densidad óptica” (DO), es la cantidad de luz absorbida por el objeto y puede expresarse de la siguiente manera:
Transmitancia (T):
Para obtener más información sobre los fundamentos de las técnicas de la espectroscopia ultravioleta-visible, descargue la guía “Aplicaciones y fundamentos de la espectrofotometría”.
¿Qué es la ley de Beer-Lambert?
La ley de Beer-Lambert establece que la cantidad de energía que absorbe una solución es proporcional al paso de luz y a la concentración. En pocas palabras, una solución más concentrada absorbe más luz que una diluida.
La fórmula matemática de la ley de Beer-Lambert es:
A = ϵ.d.c
Donde ϵ = absortividad molar, d = paso de luz y c = concentración. La absortividad molar es una constante física única de la muestra que está relacionada con la capacidad de la muestra de absorber luz a una determinada longitud de onda. ϵ presenta la unidad como L·mol-1·cm-1.
Para obtener más información sobre los fundamentos de la espectroscopia ultravioleta-visible, descargue la guía “Aplicaciones y fundamentos de la espectrofotometría” de METTLER TOLEDO.
¿Cuál es la diferencia entre los espectrofotómetros de barrido y de red de diodos?
Un espectrofotómetro UV-VIS es un instrumento diseñado para medir la absorbancia en la región UV-VIS mediante la ley de Beer-Lambert. Mide la intensidad de la luz que atraviesa una solución de muestra en una cubeta y la compara con la intensidad de la luz antes de atravesar la muestra.
Los componentes principales de un espectrofotómetro UV-VIS son una fuente de luz, un portamuestras, un dispositivo de dispersión para separar las distintas longitudes de onda de la luz y un detector adecuado.
Espectrofotómetro de barrido
Los espectrofotómetros de barrido convencionales se basan en el principio de realizar mediciones consecutivas de la transmitancia en cada longitud de onda definida. La luz se divide en diferentes longitudes de onda mediante una red de difracción. Se coloca una cubeta de muestra entre la red de difracción y el detector.
Espectrofotómetro de red de diodos
En un espectrofotómetro de red de diodos, la muestra se ilumina de manera conjunta, es decir, con todos los componentes espectrales de la luz a la vez, por lo que absorbe simultáneamente la luz de diferentes longitudes de onda. A continuación, una red de reflexión difracta la luz transmitida. Esta instrumentación ayuda a adquirir el espectro UV-VIS más rápidamente de lo que se puede obtener con un espectrofotómetro de barrido tradicional.
En comparación con un espectrofotómetro de barrido, un espectrofotómetro de red de diodos no tiene piezas móviles.
Para obtener más información, descargue “Red de diodos frente a barrido”. En el artículo técnico, se comparan los dos tipos consolidados de espectrofotómetros UV-VIS y se evalúan sus prestaciones y ventajas.
En las mediciones de UV-VIS delicadas, especialmente en el control de calidad clínico, farmacéutico o industrial, es fundamental que el rendimiento del instrumento de espectrofotometría se ajuste a las especificaciones. Por tanto, debe verificarse el rendimiento de forma regular. Los resultados de la calibración también deben registrarse y almacenarse.
Descargue “¿Cómo deberían llevar a cabo los laboratorios UV-VIS la calibración de los espectrofotómetros?” para conocer la importancia de la calibración en relación con las revisiones del capítulo sobre UV-VIS que se encuentran en la Farmacopea Europea 10 y la USP42-NF37.
Principales parámetros que calibrar en un espectrofotómetro UV-VIS
En la siguiente tabla, se muestran los principales parámetros que deben calibrarse en un espectrofotómetro UV-VIS.
Test de prestaciones
Material de referencia certificado (CRM)
Parámetros de comprobación del instrumento
Criterios de aceptación
USP42-NF37
Farmacopea Europea 10
Exactitud y repetibilidad
de la longitud de onda
Ho(ClO4)3: 4 % Ho2O3 en 10 % v/v HClO4
Blanco: aire
14 longitudes de onda
(240 nm-650 nm)
Xe: 2 longitudes de onda (260,6 y 528,6 nm)
UV (200-400 nm): ±1 nm
VIS (400-780 nm): ±2 nm
(D. T.) <0,5 nm
UV (<400 nm):
±1 nm
VIS (>400 nm):
±3 nm
Exactitud
y repetibilidad
fotométricas**
K2Cr2O7 en 0,001 M HClO4
Blanco: 0,001 M HClO4
60 mg/l
0 A-2 A,
235, 257, 313, 350 nm
Para absorbancia ≤ 1 A
Exactitud: ±0,010 A
Repetibilidad:
D. T. ≤ 0,005 A
Para absorbancia > 1 A
Exactitud: ±1 %
Repetibilidad:
D. T. ≤ 0,5 %
Exactitud: ±0,010 A o ±1 %, lo que sea mayor
Ácido nicotínico en
0,1 M HCl
Blanco: 0,1 M HCl
12 mg/l
0,26 A-1,6 A
213, 261 nm
Linealidad fotométrica
K2Cr2O7 en 0,001 M HClO4
Blanco: 0,001 M HClO4
6-200 mg/l, hasta 3,0 A,
235, 257, 313, 350 nm
Todos los filtros medidos cumplen loscriterios de aceptación de la exactitud fotométrica
R2 > 0,999
Ácido nicotínico en
0,1 M HCl
Blanco: 0,1 M HCl
6-60 mg/l, hasta 2,5 A
213, 261 nm
Luz parasitada según el procedimiento A
(SFRM)
1,2 % m/v KCl/H2O;
10 mm de paso de luz
Blanco: 1,2 % m/v KCl/H2O, 5 mm de paso de luz
Amáx. a 198 nm
≥0,7 A
(NA)
Luz parasitada según el procedimiento B (SWM)
1,2 % m/v KCl/H2O;
10 mm de paso de luz
Blanco: H2O, 10 mm de paso de luz
Amáx. a 198 nm
≥2,0 A
≥2,0 A
Resolución
0,02 % v/v tolueno en n-hexano
Blanco: n-hexano/
n-heptano (Farmacopea Europea 10)
Amáx., 269/Amín., 267
>1,3
Los niveles se indican en la correspondiente monografía
** No se especifica la repetibilidad fotométrica (precisión) en la Farmacopea Europea
D. T. = desviación típica
3. La ciencia de los colores
Fundamentos de las mediciones del color
Los colores hacen que nuestro mundo sea más interesante. Cuando vemos un objeto, la luz que este refleja entra en nuestros ojos y la recogen varios tipos de fotorreceptores de la retina. Según la sensibilidad de los fotorreceptores, cada persona puede percibir el mismo color de forma diferente.
Para aceptar la exactitud de un color específico de manera universal, hay que asignar valores numéricos. En resumen, los equipos de medición, como los espectrofotómetros y los colorímetros, arrojan los resultados del color en forma de valores para asegurar la exactitud y repetibilidad de la determinación del color.
Los espectrofotómetros cuantifican los datos de color recogiendo y filtrando las longitudes de onda transmitidas a través de una muestra. Se aplica una ecuación matemática a los datos espectrales para asignar el color a una escala de colores.
La escala de colores CIE (Commission internationale de l'éclairage) se define mediante tres parámetros: tono, croma y luminosidad.
El tono es el color dominante de un objeto. La combinación de los colores primarios y secundarios conforma el tono.
El croma, también conocido como “saturación”, describe lo intenso o apagado que es un color.
La luminosidad es la intensidad luminosa del color (si es oscuro o claro).
Cada sistema de colores CIE usa tres coordenadas para localizar un color en una escala. Las tres escalas de colores primarios son el triestímulo CIE XYZ, CIE L*a*b* y CIE L*u*v*.
Por ejemplo, cuando un color se expresa en CIE L*a*b*:
L* define la luminosidad
a* indica el valor rojo/verde
b* indica el valor amarillo/azul
Si usamos la escala de colores CIE L*a*b*, las coordenadas del rojo de la imagen de la rosa serían:
L* = 29,00, a* = 52,48 y b* = 22,23
Para obtener más información sobre los fundamentos de las mediciones del color, descargue la guía.
El color es un factor clave para el reconocimiento instantáneo.
Ofrecer una experiencia visual satisfactoria a los clientes puede influir en la decisión de compra. Por tanto, el color es esencial en la definición de la identidad de la marca y la uniformidad del producto.
Existen diferentes escalas de color para definir de forma exclusiva un producto según los estándares industriales. Entre estas escalas, se incluyen:
Escala
Estándar
Aplicaciones
Saybolt
ASTM D156, ASTM D6045
Para determinar si el combustible (queroseno, gasolina, diésel, nafta, etc.) está contaminado o se ha degradado durante su almacenamiento
APHA/Pt-Co/Hazen
ASTM D1209
Índice de amarillez empleado como métrica para las comprobaciones de la pureza en las industrias del agua, química, petrolera y del plástico
Gardner
ASTM D1544/D6166, DIN EN ISO 4630-2
Para comprobar productos tales como resinas, ácidos grasos, barnices y aceites secantes que han obtenido su color por calentamiento
CIELab
DIN EN 11664-4, DIN 5033-3, 4630, ASTM Z 58.7.1 DIN 6174
Control de calidad en las industrias de aromas y fragancias y bebidas y alimentación
Para medir la intensidad y la turbidez (enturbiamiento) del color en unidades EBC de la cerveza, las maltas y el caramelo, entre otros
USP/EUP
Monografía USP-24 631, método EP 2.2.2
Control de calidad de fármacos
Hess-Ives
Método de comprobación DGK F 050.2
Se usa para comprobar productos químicos y líquidos tensoactivos (principalmente en la industria cosmética)
4. Análisis de microvolúmenes mediante un espectrofotómetro UV-VIS
¿Cómo realizar un análisis de microvolúmenes en la espectroscopia ultravioleta-visible?
Un espectrofotómetro de microvolúmenes mide volúmenes de muestra de tan solo 1 µl. La concentración de ácidos nucleicos en una muestra suele ser del orden de nano o microgramos por mililitro.
La dilución de estos microvolúmenes y la obtención de resultados exactos suponen todo un reto. Por tanto, el microanálisis sin dilución resulta esencial para el análisis posterior de los ácidos nucleicos.
Durante el análisis de los ácidos nucleicos, la muestra de microvolumen se pipetea en el compartimento fino de la superficie del pedestal. La fibra óptica guía el haz de luz procedente de la fuente de luz hasta la plataforma de microvolúmenes. Como el paso de luz se reduce al orden de un milímetro, se puede analizar con precisión una mayor concentración de analito sin necesidad de realizar varias diluciones.
Un sistema de microvolúmenes usa la tecnología de fibra óptica junto con las propiedades inherentes de la muestra (como la tensión superficial) para retener la muestra en la plataforma del pedestal y determinar la absorbancia de las muestras en tiempo real a bajos volúmenes.
Con estas ventajas, el análisis de microvolúmenes se convierte en una opción idónea para el análisis biomolecular.
Realice el curso on-line archivado “Maximize Workflow Accuracy through Good UV/VIS Practice in Nucleic Acid Analyses” (Maximización de la exactitud del flujo de trabajo a través de la Good UV-VIS Practice en el análisis de ácidos nucleicos) para obtener consejos y trucos sobre el análisis de microvolúmenes.
Control de calidad de ácidos nucleicos La cuantificación de los ácidos nucleicos es un método preanalítico esencial para obtener resultados exactos y fiables en muchos ensayos de biología molecular, como la secuenciación de última generación (NGS), la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR en tiempo real (PCR cuantitativa o qPCR), la clonación y la transfección.
El control cualitativo y cuantitativo de los ácidos nucleicos puede realizarse mediante la determinación de su pureza y concentración.
Métodos de análisis de ADN La proteína A260 ofrece la correlación de la concentración de nucleótidos y la proteína A280 ofrece la de las proteínas residuales. Los aminoácidos tirosina y triptófano absorben a 280 nm y la fenilalanina absorbe a 260 nm. Esto permite calcular la relación A260/A280 para la pureza del ADN mediante mediciones directas de la absorbancia. El ADN de buena calidad tendrá una relación A260/A280 de 1,7-2,0.
Ensayos de cuantificación de proteínas Los diferentes métodos de cuantificación de proteínas totales incluyen los ensayos de la proteína A280, del ácido bicinconínico (BCA), de Bradford, de Lowry, de Pierce y otros más novedosos. Las proteínas en soluciones tienen máximos de 280 nm debido a los aminoácidos con anillos aromáticos y mínimos de alrededor de 220 nm debido a la presencia de enlaces peptídicos.
La concentración se calcula mediante la fórmula de Warburg:
Concentración de proteínas (mg/ml) = 1,55 X (lectura de A280) – 0,76 X (lectura de A260)
Para obtener más información sobre los análisis de ADN mediante espectroscopia ultravioleta-visible, descargue el editorial de la aplicación “260/280 Ratio: Indicator of Protein Contamination” (Relación 260/280: indicador de contaminación proteica).
¿Cuáles son los errores más comunes en las mediciones y la calibración de UV-VIS?
Se puede conseguir una buena exactitud y precisión en las mediciones de UV-VIS si se toman precauciones para evitar los errores. Entre los riesgos de error más habituales que deben tenerse en cuenta al realizar las mediciones de UV-VIS, se incluyen:
Características espectrales. La caracterización espectral se realiza durante el proceso de calibración. Los principales factores que pueden llevar a resultados erróneos son la exactitud de la longitud de onda, el ancho de banda espectral, la luz parasitada y la linealidad.
Características fotométricas. Las características fotométricas incluyen la sensibilidad espectral de la fuente de luz, la sensibilidad dependiente de la temperatura de la fuente de luz y del detector, etc.
Interacciones ópticas. Las radiaciones de la fuente de luz pueden interactuar con el material de la cubeta, lo que altera la intensidad de la absorbancia de la muestra. Estas interacciones ópticas pueden evitarse si se selecciona el material adecuado para la cubeta.
Factores diversos. Otros factores, como la temperatura, las fluctuaciones de la tensión de la línea, las vibraciones, la contaminación o el calentamiento de la muestra por el fotómetro, también afectan negativamente a las mediciones.
GUVP™
Aunque no se pueden evitar todos los errores, sí se pueden minimizar para obtener mejores resultados.
Descargue el folleto de Good UV-VIS Practice “Trustworthy Results for UV/Vis Spectroscopy” (Resultados fiables en la espectroscopia ultravioleta-visible).
¿Cómo se elige la cubeta adecuada para los análisis?
La elección de la cubeta adecuada implica seleccionar el material y el tamaño apropiados en función de la muestra y el instrumental.
El material de la cubeta debe tener suficiente capacidad de transmisión a una longitud de onda determinada. La atenuación de la luz en las paredes de la cubeta no debería afectar al resultado de los análisis. Las cubetas de vidrio no se usan en la región ultravioleta para los análisis por debajo de 370 nm, ya que absorben la radiación. Se recomienda usarlas únicamente en la región visible.
En la siguiente tabla, se indican los rangos de transmisión de uso de las cubetas:
Material
Rango de transmisión teórico (nm)
Cuarzo UV lejano
170-2700
Cristal óptico
320-2500
Cuarzo IR cercano
220-3800
Sílice UV
220-2500
Plástico UV
220-900
Célula PS desechable
340-750
Célula PMMA desechable
285-750
El tamaño de las cubetas también afecta a la capacidad de medición. El paso de luz de radiación nominal de la cubeta es de 10 mm. Dependiendo de las muestras, el paso puede variar entre 1 mm y 100 mm.
Las cubetas estándar pueden usarse para la mayoría de las muestras en estudio. Las cubetas comunes de absorción y fluorescencia tienen una base externa de 12,5 × 12,5 mm, una altura de 45 mm y unas dimensiones internas de 10 × 10 mm.
Las cubetas de paso de luz amplio (con un paso de luz superior a 10 mm) se usan cuando la muestra está demasiado diluida o se vaporiza o sufre un cambio químico durante el proceso de medición.
Las cubetas de paso de luz corto (con un paso de luz inferior a 10 mm) se usan cuando la absorbancia es alta y la dilución resulta difícil.
¿Cómo manipular correctamente las cubetas?
Al manipular las cubetas, llévelas siempre por los lados esmerilados. Evite tocar las superficies ópticas transparentes con los dedos, ya que las huellas dactilares pueden provocar una absorbancia significativa y, por tanto, afectar a la exactitud.
Evite usar pipetas de vidrio de Pasteur para llenar la cubeta; podrían rayar la superficie óptica y causar más interferencias. Se recomienda emplear las pipetas con puntas de plástico desechables.
La limpieza de las cubetas influye notablemente en los resultados, por lo que debemos considerarla como un factor de gran importancia.
Se recomienda seguir estos pasos para limpiar en profundidad las cubetas de cuarzo:
Sumerja las cubetas en la solución de limpieza.
Retire la solución de limpieza y enjuague las cubetas con agua desionizada.
Lave las cubetas con etanol o acetona, salvo en los casos de proteínas (consulte la tabla siguiente).
Seque las cubetas con un paño sin pelusa y dejándolas secar al aire o en un horno.
En la siguiente tabla, se indican los rangos de transmisión de uso de las cubetas.
Soluciones acuosas
Moléculas orgánicas
Dificultad para eliminar partículas
Proteínas
Metales pesados
Ácidos grasos
Soluciones de limpieza
3 M HCl y etanol a partes iguales en volumen
Lavado con ácido nítrico al 50 %
HNO3 concentrado o 2 M HCl
Etanol y 3 M HCl a partes iguales en volumen
Incubación a temperatura ambiente con tripsina
(El etanol y la acetona no se recomiendan para la limpieza)
Ácido sulfúrico 2 M y agua desionizada al 50 % a partes iguales en volumen
Agua regia
IPA y agua desionizada a partes iguales en volumen
Tiempo de inmersión*
10 minutos
10 minutos
30 segundos
Toda la noche
20 minutos
Secado
* El tiempo de inmersión indicado en la tabla es una estimación aproximada; sin embargo, solo se recomienda sumergir las cubetas hasta que desaparezcan las manchas o contaminantes.
Las cubetas de vidrio pueden limpiarse enjuagándolas con acetona o etanol y, luego, con agua. Se recomienda que se dejen secar al aire.
Las cubetas de plástico pueden lavarse con agua desionizada varias veces. No se recomienda lavar las cubetas de plástico con productos químicos.
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Buenas prácticas para el uso de espectrofotómetros de microvolúmenes
Prepare la muestra La sensibilidad del instrumento puede ser baja en las concentraciones diluidas de muestras biológicas. Para aumentar la sensibilidad de dichas muestras, considere la posibilidad de tomar una mayor concentración de la muestra. Las mediciones de microvolúmenes suelen necesitar entre 1 y 2 µl de volumen de muestra. Use pipetas calibradas para tomar la muestra. Se debe tener cuidado de preparar una muestra homogénea y tomarla para el análisis.
Limpie la plataforma de microvolúmenes Asegúrese de limpiar debidamente la superficie del pedestal de los microvolúmenes y el espejo. Basta con limpiar las superficies con un paño sin pelusa y con agua desionizada. Si se usa una solución tampón, detergentes o una muestra pegajosa, limpie la superficie varias veces antes de proceder a la siguiente muestra.
Coloque la muestra en la plataforma Coloque la muestra en la superficie de forma lenta y constante para evitar la formación de burbujas.
Trabaje dentro de los límites de detección Conozca los límites de detección más bajos y más altos del instrumento, y trabaje dentro de ese rango.
Prácticas generales para la medición exacta de UV-VIS
Tenga cuidado al preparar la muestra y pipetearla en una cubeta o una plataforma de microvolúmenes. La muestra debe ser homogénea.
Si hay partículas sólidas en suspensión en la muestra, es posible que la luz se disperse. En tales casos, filtre la muestra con un filtro de jeringa.
Llene la muestra en una cubeta teniendo en cuenta la dimensión z del portamuestras. De este modo, se asegurará de que la luz atraviese la muestra. La dimensión z es la distancia desde el fondo de la cubeta hasta la altura a la que el haz de luz pasa a través de la muestra.
Antes de cada medición, limpie la cubeta con un paño sin pelusa. Use siempre paños nuevos.
Emplee como blanco el mismo disolvente/solución tampón que se usó en la preparación de la muestra.
6. ¿Cuáles son las aplicaciones de la espectroscopia ultravioleta-visible en las distintas industrias?
La espectroscopia ultravioleta-visible se usa para una gran variedad de aplicaciones en muchos sectores, como por ejemplo:
Alimentación
Determinación del color (por ejemplo, vino), análisis del contenido (fosfato o SO2), adulteración, amargor, color, ácidos alfa, polifenoles totales, amino nitrógeno libre, antocinógeno, yodo, contenido de hierro y valores de ácido tiobarbitúrico (por ejemplo, cerveza).
Productos farmacéuticos
La espectroscopia ultravioleta-visible se usa ampliamente en la industria farmacéutica para el análisis cualitativo (prueba de identificación), el análisis de los ingredientes farmacéuticos activos (API), los estudios de disolución, el ensayo de las indicaciones del etiquetado, la creación de perfiles de impurezas o la pureza por absorción, el análisis de la composición porcentual, el análisis del color y la estabilidad de los fármacos.
Cosmética
Evaluación de la fotoestabilidad de los agentes para las formulaciones, caracterización de partículas del agente de bloqueo UV, evaluación del índice cromático, detección de adulteraciones (industria de los perfumes), estudio de las propiedades ópticas, cuantificación de colorantes, antioxidantes, etc.
Productos petroquímicos
Caracterización de petróleo crudo, cálculo de fracciones de asfaltenos, formulación de índices de contenido aromático, calidad de la gravedad del petróleo crudo, contenido de azufre, cálculo del factor de solubilidad de Hildebrand (ampliado al betún, los petróleos pesados y esquistosos, y los petróleos procedentes del craqueo catalítico fluidizado, la coquización o la licuefacción de carbón).
Productos químicos
Determinación de propiedades químicas, evaluación de la calidad final del producto acabado, estudio de la composición de los polímeros, cualificación de las aguas residuales, determinación de la pureza y la eficacia del colorante, degradación fotocatalítica de polímeros/colorantes y residuos de pesticidas en el suelo o el agua.
Biotecnología
Concentración y pureza de ácido nucleico, proteínas (A280, BCA, Biuret, Bradford Lowry u OD 600), mediciones de cultivos de células microbianos, desnaturalización de proteínas, estudios cinéticos (actividad enzimática) y muestras biológicas, como sangre, plasma, suero, etc.
METTLER TOLEDO ofrece una amplia gama de métodos de aplicación validados. Encuentre la aplicación que mejor se adapte a sus necesidades a través de nuestro motor de búsqueda on-line.
¿Cuáles son los diferentes tipos de espectroscopia?
La principal diferencia de las distintas técnicas espectroscópicas radica en la radiación que usan, la interacción entre la energía y el material, el tipo de material y las aplicaciones para las que se emplean. Las técnicas espectroscópicas que se usan con más frecuencia para los análisis químicos son la espectroscopia atómica, la espectroscopia ultravioleta-visible (espectroscopia UV-VIS), la espectroscopia infrarroja, la espectroscopia Raman y la resonancia magnética nuclear.
Tipo de espectroscopia
Tipo de radiación
Interacciones
Longitud de onda
Espectroscopia de rayos ϒ
Rayos ϒ
Núcleos atómicos
<0,1 nm
Espectroscopia de fluorescencia de rayos X
Rayos X
Electrones de capa interna
0,01-2,0 nm
Espectroscopia UV en vacío
Ultravioleta (UV)
Ionización
2,0-200 nm
Espectroscopia ultravioleta-visible
UV-VIS
Electrones de valencia
200-800 nm
Espectroscopia infrarroja y Raman
Infrarroja
Vibraciones moleculares
0,8-300 mm
Espectroscopia de microondas
Microondas
Rotaciones moleculares
Entre 1 mm y 30 cm
Espectroscopia de resonancia de espín electrónico
Espín electrónico
Espectroscopia de resonancia magnética nuclear
Ondas de radio
Espín nuclear
0,6-10 m
¿Cuáles son las diferentes interacciones moleculares en la región ultravioleta?
La absorción de la luz ultravioleta da lugar a transiciones electrónicas de niveles de energía más bajos a niveles más altos. La absorción de la radiación ultravioleta en las moléculas orgánicas se limita a determinados grupos funcionales (cromóforos) que contienen electrones de valencia de baja energía de excitación. Las transiciones/interacciones moleculares que tienen lugar debido a la absorción UV son:
π - π* (transición de pi a pi con asterisco): orbital de enlace a antienlace
n - π* (transición de n a pi con asterisco): orbital de no enlace a antienlace
Estas transiciones necesitan un grupo insaturado en la molécula para proporcionar los electrones π.
Las transiciones de σ (enlace) a σ* (antienlace) requieren un mayor nivel de energía y, por tanto, no pueden detectarse mediante espectroscopia ultravioleta-visible.
¿Cómo afectan los grupos funcionales a los espectros?
Piense en un grupo funcional que contiene átomos con uno o más pares de electrones independientes que no absorben la radiación ultravioleta/visible. Sin embargo, cuando este grupo funcional se une a un cromóforo, altera la intensidad y la longitud de onda de la absorción. Este fenómeno se denomina “auxocromo” o “grupo potenciador del color”.
La presencia de un auxocromo provoca el desplazamiento de la posición de un pico o señal a una longitud de onda más larga, lo que se conoce como “desplazamiento batocrómico” o “corrimiento hacia el rojo”. Los grupos funcionales que contribuyen a los grupos batocrómicos son sustituyentes, como los grupos de metilo, hidroxilo, alcoxi, halógeno y amino.
El auxocromo que provoca el desplazamiento de la posición de un pico o señal a una longitud de onda más corta se conoce como “efecto hipsocrómico” o “desplazamiento hacia el azul”. En realidad, la combinación de cromóforo y auxocromo se comporta como un nuevo cromóforo que tiene un máximo de absorción diferente (λmáx.). Por ejemplo, el benceno muestra un λmáx. de 256 nm, mientras que la anilina muestra un λmáx. de 280 nm. Por lo tanto, el grupo de NH2 actúa como un auxocromo y provoca el desplazamiento de λmáx. a un valor mayor.
¿Cuál es la diferencia entre el ancho de banda y la resolución espectrales en la espectroscopia ultravioleta-visible?
El ancho de banda espectral (ABE) de un espectrofotómetro está relacionado con el ancho de ranura físico y la dispersión óptica del sistema monocromador. La resolución es la capacidad de un instrumento para separar la luz en regiones de longitud de onda finitas y distintas, y para distinguir cada región finita. El ancho de banda espectral suele usarse para los instrumentos de barrido, mientras que la resolución se emplea habitualmente para los instrumentos de red de diodos.
Para la mayoría de los fines cuantitativos de las farmacopeas, es suficiente un ancho de banda espectral inferior a 2 nm, y el criterio de aceptación de la relación es 1,3. La resolución espectral puede usarse para realizar comparaciones con el ancho de banda espectral.
En la tabla, se muestra la resolución de los espectrofotómetros Excellence para UV-VIS de METTLER TOLEDO, que se mide usando tolueno en hexano, y el ABE equivalente.
Instrumento
Resolución espectral
ABE equivalente (nm)
UV5
>1,5
<2,0
UV5Bio
>1,5
<2,0
UV5Nano
>1,7
<1,5
UV7
>1,9
≤1,0
¿Cuáles son las diferentes fuentes de luz que se usan en un espectrofotómetro UV-VIS?
La mejor fuente de luz sería aquella que proporcionara una buena intensidad con poco ruido en todas las longitudes de onda ultravioletas y visibles, y que ofreciera estabilidad durante un largo periodo. A continuación, se indica una serie de fuentes de luz que suelen emplearse.
Fuente de luz
Rango de longitud de onda
(nm)
Región
Vida útil
Lámpara de filamento de wolframio
350-2500
VIS e IR
3000 h
Lámpara de descarga de deuterio
190-400
UV
1000 h
Lámpara de hidrógeno
190-400
UV
1000 h
Lámpara de destellos de xenón
190-1100
UV, VIS y NIR
5500 h*
* Corresponde a destellos de 50 Hz en un funcionamiento continuo
¿Por qué la red de difracción es mejor que un prisma?
Los prismas y las redes de difracción son elementos de dispersión típicos. Un prisma consigue la dispersión debido a la diferencia en el índice de refracción del material en función de la longitud de onda. Sin embargo, una red de difracción usa la diferencia en la dirección de la difracción de cada longitud de onda debido a la interferencia. Tanto los prismas como las redes de difracción pueden propagar los espectros de luz en muchos colores para su análisis. Sin embargo, la red de difracción es menos sensible al color de la luz y puede propagar los colores en un ángulo más amplio que el prisma. El vidrio de un prisma es transparente para la luz visible, pero absorbe y bloquea la luz de las partes infrarroja y ultravioleta del espectro. Una red de difracción con unos cientos de líneas por pulgada puede desviar la luz del centro del espectro visible en, al menos, 20 grados. El ángulo de desviación de un prisma de vidrio suele ser mucho menor.
¿Qué compuestos inorgánicos pueden medirse mediante la espectroscopia ultravioleta-visible?
Las moléculas pueden analizarse mediante espectroscopia ultravioleta-visible si poseen algún grupo funcional o conjugación, o si producen un complejo de color. Como los compuestos inorgánicos no contienen ningún grupo funcional o conjugación, el método más habitual para analizarlos es mediante una reacción con un compuesto adecuado. Esto produce un complejo de color cuya absorbancia puede medirse fotométricamente en la región visible y correlacionarse con su concentración real. Por ejemplo, el hierro suele analizarse mediante una reacción con 1,10-fenantrolina para producir un complejo de color rojo. La absorbancia del complejo se mide a 570 nm para estimar la concentración de hierro.
¿En qué se diferencian los espectrofotómetros de haz único y los de doble haz?
La principal diferencia entre un espectrofotómetro de haz único y uno de doble haz es la siguiente.
Espectrofotómetro de haz único: un solo haz de la fuente de luz atraviesa la muestra.
Espectrofotómetro de doble haz: el haz de luz de la fuente de luz se divide en dos partes; una atraviesa la muestra y la otra, la referencia.
La división del haz en un espectrofotómetro de doble haz se logra de dos maneras:
Estáticamente, con espejos de transmisión parcial o un dispositivo similar
Atenuando los haces mediante dispositivos ópticos y mecánicos móviles
¿Cómo analizar una película de polímeros sólidos mediante espectroscopia ultravioleta-visible?
El análisis de una muestra sólida se realiza principalmente mediante la estimación de su absorbancia, transmitancia y reflectancia. Entre los parámetros más comunes que se determinan para los polímeros sólidos, se incluyen el porcentaje de transmitancia, la longitud de onda de corte y el índice de amarillez. La muestra se monta en un soporte específicamente diseñado para muestras sólidas y las lecturas se realizan de la misma manera que con las muestras líquidas. Un portamuestras de muestras sólidas permite la medición de muestras sólidas, como películas o vidrio.
¿Afecta la temperatura al análisis UV-VIS?
La temperatura afecta a los valores de absorbancia. Cada disolvente sufre diferentes interacciones a distintas temperaturas. Los parámetros de la solución que cambian debido a las variaciones de temperatura son:
Velocidad de reacción. La velocidad cambia cuando se eleva la temperatura. Esto puede provocar un cambio en la actividad de la muestra. Las reacciones enzimáticas y biomoleculares son muy sensibles a la temperatura.
Solubilidad de un soluto. La solubilidad se ve afectada por las variaciones de temperatura. Una solubilidad deficiente puede dar lugar a una absorción poco precisa.
Expansión o contracción del disolvente. Esto puede provocar un cambio en la concentración de la solución y afectar a la absorbancia, ya que esta se encuentra linealmente relacionada con la concentración.
Efecto Schlieren. Este efecto puede darse con los cambios de temperatura y causar una serie de corrientes convectivas que pueden modificar la absorbancia real.
Los parámetros de las prestaciones ópticas, como el ruido fotométrico, la exactitud/repetibilidad de la longitud de onda, la repetibilidad fotométrica y la luz parasitada, no se ven afectados por la temperatura dentro de un rango de 10 a 40 °C.
No obstante, los parámetros ópticos como la resolución fotométrica (relación tolueno/hexano) y las longitudes de onda de exactitud fotométrica (K2Cr2O7 en HClO4) muestran una dependencia de la temperatura que oscila entre 0,014 y -0,034/unidad dentro de un rango de 10 a 40 °C.
Para controlar la temperatura en la espectrofotometría UV-VIS, se pueden usar sistemas termostáticos de alto rendimiento, como CuveT y CuvetteChanger. Obtenga más información aquí.
¿Qué es la luz parasitada?
La luz parasitada se define como la luz que llega al detector, que no procede de la fuente de luz del instrumento y que no sigue el camino óptico, lo que provoca una desviación en la longitud de onda correspondiente. Por tanto, la intensidad de la luz que mide el detector es superior a lo que debería ser en realidad. Por el contrario, esto también significa que la absorbancia medida es inferior a la real porque se ve reducida por la contribución de la luz parasitada. Este efecto es más prominente cuando los valores de absorbancia son más elevados (altas concentraciones de la muestra).
Descargue el artículo técnico para obtener más información sobre el origen y la medición exacta de la luz parasitada:
¿Por qué está abierto el compartimento de muestras en los espectrofotómetros de red de diodos UV-VIS?
El compartimento de muestras de los espectrofotómetros de red de diodos UV-VIS está abierto debido a que los instrumentos de red de diodos usan una óptica invertida y la detección simultánea de todas las longitudes de onda del espectro.
Óptica invertida: la luz se difracta después de haber pasado por la muestra. Debido a esto, solo una pequeña fracción de la luz ambiental externa contribuye a la señal en una región de longitud de onda determinada.
Detección simultánea: mediante un detector de red de diodos que proporciona 2048 señales de intensidad luminosa al mismo tiempo, se registra el espectro completo en un segundo. Como la medición se realiza de manera muy rápida, el efecto de la luz ambiental se reduce considerablemente.
Aplicaciones
Descargue aplicaciones específicas sobre espectrofotometría UV-VIS
