紫外可见（UV Vis）分光光度法是在不同行业与细分市场中进行各种应用的强大技术。
当物质吸收特定波长的光达到最大值时，物质与其紫外可见光谱之间会存在一种独特的关系。这种关系可用于：
通过本页，您将会了解关于紫外可见光谱及其应用的基本知识。
在下列部分中找到关于紫外可见分光光度法基础知识与应用的答案：
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吸光度（A）（亦称作光密度（OD））指物体吸收的光量，可以表示如下
透光率（T）
如想了解紫外可见光计的基本知识，请下载《分光光度法应用与基本知识》指南。
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传统的扫描式分光光度计的工作原理是：对每个定义的波长进行连续透光率测量。光由衍射光栅分成不同波长。样品比色皿放置在衍射光栅与检测机之间。
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在阵列分光光度计中，通过连续体照射样品（即：一次性得到光的所有光谱分量），因此可同时吸收不同波长的光。然后通过反射光栅衍射透射光。与使用传统的扫描式分光光度计相比，该仪器有助于更快速获取紫外可见光谱。
与扫描式紫外可见分光光度计相比，阵列式紫外可见分光光度计无可动件。
关于更多详情，请下载《阵列式与扫描式对比》。该白皮书对两种成熟的紫外可见分光光度计设置进行了比较并且对性能与优点进行了评估。
性能测试 | 法定标准物质（CRM） | 仪器测试参数 | 验收标准 | |
USP 42 NF 37 | 欧洲 药典 10 | |||
波长准确度与 重复性 | Ho(ClO4)3: 4 % Ho2O3 ，10 % v/v HClO4 空白： 空气 | 14个波长 （240 nm – 650 nm） Xe: 2个波长（260.6, 528.6 nm） | 紫外区（200~400 nm）：±1 nm 可见光区（400~780 nm）：±2 nm （标准偏差） <0.5 nm | 紫外区（< 400 nm）： ± 1 nm 可见光区（> 400 nm）： ± 3 nm |
光度 准确度与 重复性** | K2Cr2O7 ，0.001 M HClO4 空白： 0.001 M HClO4 | 60 mg/L 0 A – 2 A, 235、257、313、350 nm | 如果吸光度≤ 1A 准确度： ± 0.010A 重复性： 标准偏差 ≤ 0.005 A
如果吸光度> 1A 准确度： ± 1% 重复性： 标准偏差 ≤ 0.5%
| 准确度： ±0.010 A或±1 %，以较大值为准
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烟酸： 0.1 M HCl 空白： 0.1 M HCl | 12 mg/L 0.26 A – 1.6 A 213、261 nm | |||
光度线性 | K2Cr2O7 ，0.001 M HClO4 空白： 0.001 M HClO4
| 6 – 200 mg/L，最大吸光度值3.0 A， 235、257、313、350 nm | 所有被测量的过滤器均符合 光度准确度验收标准 | R2> 0.999 |
烟酸： 0.1 M HCl 空白： 0.1 M HCl | 6 – 60 mg/L，最大电流2.5 A 213、261 nm | |||
根据方法A测出的杂散光 (SFRM) | 1.2 % w/v KCl/H2O; 10 mm光程 空白： 1.2 % w/v KCl/H2O, 5 mm光程 | 198 nm时最大吸光度值 | ≥ 0.7 A | （NA） |
根据方法B测出的杂散光（SWM） | 1.2 % w/v KCl/H2O; 10 mm光程 空白： H2O, 10 mm光程 | 198 nm时A最大吸光度值 | ≥ 2.0 A | ≥ 2.0 A |
分辨率 | 0.02 % v/v 甲苯-正己烷溶液 空白：正己烷/ 正庚烷（欧洲 药典 10） | A最大,269/A最小,267 | >1.3 | 级别规定请参见相应专著 |
**《欧洲药典》中未指定光度重复性 （精确度） S.D. ——标准偏差 | ||||
CIE（Commission internationale de l’éclairage）色标使用三个参数进行定义：色调、色度与亮度。
每一个CIE色系利用三个坐标确定颜色在色标上的位置。三个原色色标分别为Tristimulus CIE XYZ、CIE L*a*b*与CIE L*u*v*。
例如：当一种颜色以CIE L*a*b*表达时：
使用CIE L*a*b*色标，图中玫瑰的红色坐标为：
L* = 29.00, a* = 52.48, b* = 22.23
如想更详细了解颜色测量的基础知识，请下载指南。
为了按照行业标准对产品进行独特定义，建立了不同色标。这些色标包括：
电子秤 | 标准 | 应用 |
赛波特值 | ASTM D156, ASTM D6045 | 确定燃料（煤油、汽油、柴油、石脑油等）在储存时是否受到污染或发生降解 |
APHA/Pt-Co/Hazen | ASTM D1209 | 黄度指数用作水、化学、石油与塑料工业纯度检验的指标 |
加德纳值 | ASTM D1544/D6166, DIN EN ISO 4630-2 | 用于测试通过加热获得颜色的产品，例如：树脂、脂肪酸、清漆与干性油等 |
CIELAB | DIN EN 11664-4, DIN 5033-3, 4630, ASTM Z 58.7.1 DIN 6174 | 香精与香料以及食品与饮料行业的质量控制 |
EBC | MEBAK方法2.13.2，EBC方法8.5，EBC方法9.6 | 以EBC单位测量啤酒、麦芽、焦糖等物质的颜色强度与浊度（雾度）。 |
USP/EUP | USP-24专著631，EP方法2.2.2 | 药物质量控制 |
Hess-Ives | DGK测试方法F 050.2 | 用于测试化学品与表面活性剂液体（主要用于化妆品行业） |
微量分光光度计测量容量低至1 µl的样品。样品中的核酸浓度通常为每毫升纳克或微克的数量级。
稀释这种微量样品并且获得准确的结果具有挑战性。因此，无需稀释的微量分析对于核酸的下游分析变得很重要。
在核酸分析过程中，将微量样品移液至基座表面上的上样区内。灯光束由光纤引导至微量平台。当光程减小至毫米数量级时，无需多次稀释即可精确分析更高浓度的分析物。
微量系统利用光纤技术以及样品的固有特性（例如：表面张力）将样品保持在基座平台上，并且测定微量样品的实时吸光度。
凭借这些优势，微量分析成为了生物分子分析的理想之选。
参加“通过核酸分析中的Good UV/VIS Practice（良好的紫外可见分光光度法操作规范）最大限度提高工作流程准确度”在线技术交流讲座，了解微量分析的技巧与诀窍。
核酸的质量控制
核酸定量是分析前所采用的一种必不可少的方法，可在许多分子生物学分析中获得准确可靠的结果，例如：下一代测序（NGS）、聚合酶链式反应（PCR）、实时PCR（定量PCR；qPCR）、克隆与转染。
核酸的定性与定量控制可以通过测定核酸的纯度与浓度进行。
DNA分析方法
A260和核苷酸浓度相关，A280和蛋白质的氨基酸残基相关。酪氨酸和色氨酸这两种氨基酸在280 nm处吸光，苯丙氨酸则在260 nm处吸光。这样可以直接利用吸光度测量计算A260/A280比率来检测DNA的纯度。优质DNA的A260/A280比率为1.7–2.0
蛋白质定量分析
总蛋白定量的不同方法包括A280、二辛可宁酸（BCA）、Bradford、Lowry、Pierce和其他新型检测方法。由于存在具有芳香环的氨基酸，因此溶液中的蛋白质在280 nm处具有最大值，由于存在肽键，因此在大约220 nm处具有最小值。
利用Warburg公式计算浓度：
蛋白质浓度（mg/ml）= 1.55 X（A280读数）–0.76 X（A260读数）
如想了解关于使用紫外可见光谱分析DNA的更多信息，请下载《260/280比率： 蛋白质污染指标》应用手册。
通过采取预防措施避免错误，可以在紫外可见分光光度法测量中获得良好的准确度与精确度。在进行紫外可见分光光度法测量时应当注意的常见错误风险包括：
尽管无法避免所有错误，但是可以最大限度减少错误，从而取得更好的结果。
下载Good UV/VIS Practice（良好的紫外可见分光光度法操作规范）手册《紫外可见光谱的可信结果》。
下图显示比色皿的可用透射范围：
材料 | 理论透射范围（nm） |
远紫外石英 | 170——2700 |
光学玻璃 | 320——2500 |
近红外石英 | 220——3800 |
紫外硅 | 220——2500 |
紫外塑料 | 220——900 |
一次性PS比色皿 | 340——750 |
一次性PMMA比色皿 | 285——750 |
比色皿的尺寸也会影响到测量能力。比色皿的标称入射光程为10 mm。根据样品，光程有可能为1 mm至100 mm。
标准比色皿可用于大多数研究中的样品。常见的吸收与荧光比色皿的外部底座为12.5 mm x 12.5 mm，高度为45 mm，内部尺寸为10 mm x 10 mm。
当样品太稀或样品在测量过程中汽化或发生化学变化时，使用长光程比色皿（光程长度超过10 mm的比色皿）。
当吸光度高且难以稀释时，使用短光程比色皿（光程小于10 mm的比色皿）。
如何正确转移比色皿？
转移比色皿时，始终使用磨砂边携带比色皿。避免用手指触摸透明的光学表面，因为指纹会造成大量吸光，从而影响到准确度。
避免使用玻璃巴氏移液器给比色皿加液，这样有可能刮擦光学表面，从而造成更大干扰。建议使用带有一次性塑料吸头的移液器。
比色皿的清洁度会对结果产生明显影响，因此必须将其视作一个非常重要的因素。
建议执行下列步骤对石英比色皿进行深度清洁：
下图显示比色皿的可用透射范围。
| 水溶液 | 有机分子 | 难以去除颗粒 | 蛋白质 | 重金属 | 脂肪酸 |
清洗液 | 等容积的3 M HCl与乙醇
用50%硝酸清洗 | 浓缩HNO3或2 M HCl | 等容积的乙醇与3 M HCl
| 在室温下用胰蛋白酶培养
（不建议使用乙醇和丙酮进行清洁。） | 等容积硫酸2 M与50%去离子水
王水
| 等容积的IPA与去离子水 |
浸泡时间* | 10分钟 | 10分钟 | 30秒 | 一整夜 | 20分钟 | 擦拭 |
*表中所示浸泡时间为粗略估算；但是仅建议您浸泡比色皿，直至污渍/污染物被去除。
可以通过用丙酮或乙醇冲洗比色皿，然后用水冲洗的方式清洁玻璃比色皿。建议进行风干处理。
可以使用去离子水多次清洗塑料比色皿。不建议使用化学品清洗塑料比色皿。
食品
颜色测定（例如：葡萄酒）、含量分析（磷酸盐、SO2）、掺假、苦度、颜色、α酸、总多酚、游离氨基氮、花青素、碘、铁含量与硫代巴比妥酸值（例如：啤酒）
制药
紫外可见光光谱在制药行业中广泛用于定性分析（鉴别试验）、活性药物成分（API）分析、溶出度研究、标示值分析、杂质分析/吸收纯度、百分含量分析、颜色分析、药物稳定性
化妆品
制剂的光稳定性评估、紫外线阻断剂的颗粒表征、评估颜色指数、检测掺假（香水行业）、光学特性研究、染料与抗氧化剂等物质的定量
石油化工
原油表征、沥青质馏分计算、芳烃含量指数表示、原油比重质量、硫含量、计算希尔德布兰德溶解因子。（扩展至沥青、重油与页岩油以及由催化裂化、焦化或煤液化产生的油）
化工
化学特性测定、成品最终质量评估、聚合物成分研究、废水定性、纯度与染色效率测定、聚合物/染料的光催化降解、土壤或水中的残留农药
生物技术
核酸、蛋白质（A280、BCA、Biuret、Bradford Lowry、OD 600）的浓度与纯度、微生物细胞培养测量、蛋白质的变性、动力学研究（酶活性）、生物样品（例如：血液、血浆、血清等）
梅特勒托利多提供多种经过验证的应用方法。通过我们的在线搜索引擎找到最适合您需求的应用。
不同的光谱法主要由它们使用的辐射、能量与材料之间的相互作用以及它们用于的材料与应用类型进行区分。常用于化学分析的光谱法包括：原子光谱、紫外可见光谱、红外光谱、拉曼光谱与核磁共振。
光谱类型 | 辐射类型 | 交互作用 | 波长 |
ϒ射线光谱 | ϒ射线 | 原子核 | <0.1 nm |
X射线荧光光谱 | X射线 | 内层电子 | 0.01——2.0 nm |
真空紫外光谱 | 紫外（UV） | 离子化 | 2.0——200 nm |
紫外可见光谱 | 紫外可见分光光度法 | 价电子 | 200——800 nm |
红外与拉曼光谱 | 红外 | 分子振动 | 0.8——300 mm |
微波光谱 | 微波 | 分子转动 | 1 mm——30 cm |
电子自旋共振光谱 | 电子自旋 | ||
核磁共振光谱 | 无线电波 | 核自旋 | 0.6——10 m |
吸收紫外光会造成从低能量级向高能量级的电子跃迁。对有机分子内紫外辐射的吸收仅限于包含低激发能价电子的某些官能团（发色团）。由于紫外吸收而发生的分子跃迁/相互作用是：
这些跃迁需要分子中的一个不饱和官能团提供π电子。
Σ（键合）至σ*（反键合）跃迁需要更高能量，因此无法利用紫外可见光谱检测。
假设有一个包含原子的官能团，原子中有一对或多对不吸收紫外线/可见光辐射的孤对电子。然而，当这个官能团连接到发色团时，会改变吸收的强度与波长。这种现象称作辅助色素或增色基团。
辅助色素的存在会导致峰值或信号向更长波长的位置偏移，这种现象称作红移。对红移基团产生作用的官能团是甲基、羟基、烷氧基、卤素和氨基等取代基。
导致峰值或信号向更长波长的位置偏移的辅助色素称作蓝移。实际上，发色团和辅助色素的组合如同一个具有不同吸收最大值（λmax）的新发色团。例如，苯在256 nm处显示λmax，而苯胺在280 nm处显示λmax。因此，NH2基团用作辅助色素，并导致λmax朝更大值移动。
分光光度计的光谱带宽（SBW）与单色仪系统的物理狭缝宽度和光学色散有关。分辨率指仪器将光分成有限、明显波长区域并且区分每个有限区域的能力。光谱带宽通常用于扫描仪器，而分辨率通常用于阵列仪器。
对于大多数药典定量目的，2 nm以下的光谱带宽足以，比率的验收标准为1.3。光谱分辨率可用于与光谱带宽的比较。
表中显示了梅特勒托利多的超越系列紫外/可见分光光度计的分辨率，使用正己烷中的甲苯以及等效光谱带宽对分辨率进行测量。
仪器 | 光谱分辨率 | 等效光谱带宽（nm） |
UV5 | >1.5 | < 2.0 |
UV5Bio | >1.5 | < 2.0 |
UV5Nano | >1.7 | < 1.5 |
UV7 | > 1.9 | ≤ 1.0 |
最好的光源是在所有紫外与可见光波长范围内具有良好强度和低噪声并确保长期稳定性的光源。如下所述，有一系列常用的光源。
光源 | 光谱范围 （nm） | 区域 | 使用寿命 |
钨丝灯 | 350——2500 | VIS + IR | 3,000小时 |
氘弧灯 | 190——400 | UV | 1,000小时 |
氢灯 | 190——400 | UV | 1,000小时 |
闪烁氙灯 | 190——1100 | UV + VIS + NIR | 5,500小时* |
*与持续运行时50 Hz闪烁对应
棱镜与衍射光栅是典型的色散元件。棱镜利用不同波长的材料折射率差异实现色散。而衍射光栅利用的是干扰造成的每一种波长的衍射方向差异。棱镜和衍射光栅都可以将光谱扩散成用于分析的多种颜色。不过衍射光栅对光颜色的敏感度较低，并且扩散颜色的角度大于棱镜。棱镜中的玻璃对可见光是透明的，但它会吸收和阻挡光谱中的红外与紫外光。每英寸有几百条线的衍射光栅可以将可见光谱中间的光偏转至少20度。玻璃棱镜的偏转角度通常小于此角度。
如果分子拥有任何官能团或偶联物，或者如果它们可产生彩色复合物，则可以使用紫外可见光谱分析分子。由于无机化合物不包含任何官能团或偶联物，因此与适合的化合物发生反应是分析它们的常用方法。这会产生一种彩色复合物，其吸光度可以在可见光区域中进行光度测量，并且与其实际浓度相关联。例如分析铁时通常采用的方法是：与1, 10——邻苯二酚发生反应，从而产生一种红色络合物。在570 nm处测量复合物的吸光度，以估算铁的浓度。
单光束与双光束分光光度计之间的主要区别如下：
单光束分光光度计： 光源发出的单光束透过样品
双光束分光光度计： 光源发出的光束分成两部分：一部分透过样品，另一部分透过参比物
双光束分光光度计中的光束分裂通过两种方式实现：
主要通过估算吸光度、透光率与反光率分析固体样品。为固体聚合物确定的常用参数包括透光率百分比、截止波长与黄度指数。样品安装在专门为固体样品设计的支架上，读数的方式与液体样品相同。固体样品支架能够测量薄膜或玻璃等固体样品。
温度会对吸光值产生影响。不同的溶剂在不同的温度条件下会经历不同的相互作用。因温度变化而改变的溶液参数为：
光度噪声、波长准确度/重复性、光度重复性和杂散光等光学性能参数在10——40 °C范围内不受温度影响。
而诸如光度分辨率（甲苯/己烷比）与光度准确度波长（K2Cr2O7 in HClO4）之类的光学参数在10——40 °C内显示出从0.014到-0.034/单位的温度依赖性。
使用高性能恒温系统（例如：酷T与CuvetteChanger）可以实现对紫外可见分光光度法的温度控制。点击此处了解更多信息。
杂散光定义为到达检测机的光，该光不来自于仪器的光源并且不遵循光路，导致在相应的波长发生偏差。因此，检测机测量的光强度高于实际应有的强度。相反，这还意味着测量的吸光度低于真正吸光度，因为杂散光会导致其降低。这种效应在吸光度值更高（样品浓度高）时更为明显。
下载白皮书，了解关于杂散光来源和准确测量的更多信息：
紫外可见阵列分光光度计中的样品室是打开的，这是因为阵列式仪器使用反向光学器件并同步检测光谱的所有波长。
反向光学器件： 光线穿过样品后发生衍射。因此，只有一小部分外部环境光会对某一波长区域内的信号产生作用。
同步检测： 使用同时提供2048个光强度信号的阵列式检测机可在一秒内记录全光谱。由于测量速度非常快，因此可明显减小环境光的影响。
